1 引言(Introduction)

磷是一种不可再生资源(Rittmann et al., 2011), 中国近年来已由磷出口大国逐渐转变成为磷进口大国, 目前中国的可采天然磷矿石不论是品质还是储量均已下降, 如果按照目前的开采速度磷资源仅能支持不足百年(Cordell et al., 2009；Chowdhury et al., 2017).磷资源短缺这一问题已经日趋严重, 而同时中国也是一个磷资源消耗大国, 有超过75%的磷需求在农业化肥方面.研究表明(Yuan et al., 2012), 以中国目前的城市污水量水质推算, 从中回收的磷资源可以满足中国15%~20%的磷需求, 50 mg·L^-1的磷浓度被认为是鸟粪石结晶磷回收法较为经济可行的最低回收液浓度；同时, Cornel等(2009)研究表明, 磷回收液浓度越高, 结晶回收的效率越高, 代价越低.因此, 对城市污水进行磷回收的前提是对低浓度磷酸盐进行富集.

目前建造的城市污水磷回收工艺以基于强化除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal, EBPR)理论的活性污泥法为主(Xia et al., 2014；Acevedo et al., 2015；Valverde-Perez et al., 2015), 主要通过泥相/水相侧流进行磷回收, 磷回收效率可达30%~54%(郝晓地等, 2006；2008；Zhou et al., 2014; Qiang et al., 2015).但经过有机碳回收转移的城市污水的低进水有机碳、低进水磷浓度水质将会对传统活性污泥法的正常运行带来困难.城市污水全面资源化是未来污水处理的发展方向, 这一具有变革意义的理念体现了资源循环利用的可持续发展观念, 已经在水污染控制工程领域形成广泛共识.目前, 有机碳回收转移-磷高倍富集回收-氮生物转化的运行模式被认为适合中国未来城市污水厂可持续发展的理念, 即对城市污水中的有机碳通过水热等手段进行富集转移并回收, 紧接着对有机碳回收后的污水进行磷回收, 最后利用厌氧氨氧化工艺(Lotti et al., 2014)自养菌的特性高效去除氮.附着生长系统(生物膜法)在不利生长条件下表现出很强的适应性, 本课题组前期研究表明(郑莹等, 2017；孟璇等, 2018；徐林建等, 2019), 利用生物膜可以在好氧阶段吸收污水中的磷并在排水后停留在反应器中, 紧接着在厌氧阶段将富集到的磷释放在同一厌氧回收液中, 随着运行周期增加, 污水中的磷会被逐渐富集转移至厌氧回收液中.基于生物膜法的序批式反应器(Biofilm Sequencing Batch Reactor, 以下简称BSBR), 在好氧进水无碳源的情况下, 可以维持较好的系统除磷性能.

随着回收液中磷浓度的增加, 生物膜在厌氧阶段会面临一个渐增的释磷阻力.为了得到更高浓度的磷回收液, 一些科研人员均采用在厌氧阶段投加高浓度碳源的手段刺激厌氧释磷(Kodera et al., 2013; Wong et al., 2013; Yuan et al., 2016; Tian et al., 2017; Wong et al., 2018).然而, 过高碳源的投加在实际应用中不具有经济性.为了寻找更佳的厌氧释磷刺激手段, 有必要针对BSBR工艺的厌氧释磷条件和影响因素进行系统的研究.

基于此, 本研究利用BSBR工艺, 对生物膜磷回收法的厌氧释磷的影响因素进行量化探究.首先探究并分析BSBR工艺在好氧无碳源投加、厌氧仅200 mg·L^-1碳源投加下的运行性能；然后通过批次实验研究厌氧碳源投加量、投加方式对BSBR工艺厌氧释磷的影响；最后分析不同生物膜蓄磷量下, 厌氧释磷量和碳源消耗的差异.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 反应器设计和运行

反应器(图 1)主要包括一个6 L的反应器容器、400 L的好氧进水罐、10 L的回收液罐、2 L的营养液罐.选用悬浮填料(K3, 25 mm), 填料填充比为40%.BSBR反应器一个运行周期分为两个运行阶段：①好氧阶段, 合成废水由好氧进水罐进入主反应器中直至5 L, 经过3 h好氧曝气后通过电磁阀直接排放出水；②厌氧阶段, 回收液从回收液罐进入主反应器中直至5 L, 经过2 h厌氧阶段后由蠕动泵打回回收液罐.经过多个周期循环, 磷被富集在回收液罐中.BSBR运行以5 h为一个周期, 包括180 min(含5 min进水和5 min出水时间)的好氧运行时间和120 min(含5 min进水和5 min出水时间)的厌氧运行时间.好氧阶段溶解氧控制在3.5 mg·L^-1左右, 厌氧阶段溶解氧控制在0.5 mg·L^-1以下, 反应器室温为(20±2) ℃.

2.2 批次实验设计

在反应器运行稳定后, 会对碳源、停留时间及不同外界初始释放浓度进行批次实验来探究厌氧释磷的影响因素.采用六联搅拌机, 根据实际实验组组数的需要, 将填料分成等份, 厌氧用水使用回收罐中的回收液, 每个搅拌罐中的回收液体积始终保持填料比为40%的比例, 搅拌机的搅拌强度与主反应器一致, 通过设置不同的碳源投加量、停留时间及外界磷浓度来判断释磷效果.

2.3 合成废水及回收液成分

本实验挂膜所用活性污泥取自苏州城市污水厂, 好氧进水和回收液用合成废水水质如表 1所示.本研究中使用的合成水包括(mg·L^-1)：KH₂PO₄ 43.8、NaHCO₃ 40.0、NH₄Cl 85.0、MgSO₄·7H₂O 90.0、CaCl₂·2H₂O 13.8, 以及30 mL具有以下成分的微量营养素溶液(mg·L^-1)：FeCl₃·6H₂O 1.50、H₃BO₃ 0.15、CuSO₄·5H₂O 0.03、KI 0.18、MnCl₂·4H₂O 0.12、Na₂MoO₄·4H₂O 0.06、ZnSO₄·7H₂O 0.12、CoCl₂·6H₂O 0.15, 以及68.5 mL 0.5 mol·L^-1的EDTA(Smolders et al., 1994), 回收液组成(mg·L^-1)：CH₃COOH 231.75、CaCl₂·2H₂O 1.38、MgSO₄·7H₂O 12.60、NH₄Cl 13.77, 以及少量微量元素(Wong et al., 2013).

2.4 分析及计算方法

水质监测指标：COD采用重铬酸钾法(DR-2800, Hach Co., Loveland, Co)测定；PO₄^3--P采用钼锑分光光度法测定；溶解氧采用Inlab OXI7300溶解氧仪(Germany, WTW)测定；pH采用Inlab OXI7300 pH计(Germany, WTW)测定.采用SEM-EDS结合SMT法来判断BSBR工艺不同阶段生物膜内的磷含量, 利用Illumina MiSeq sequencing来监测BSBR系统内微生物种群结构的变化.

磷回收率为一个回收周期中回收液的总磷量与一个周期中磷的总投加量的比值.磷含量测定：①SEM-EDS法：均匀取样后, 多角度取点测试取平均值, 换算为g·g^-1, 即1000 mg·g^-1.②SMT法：生物膜取样冷冻干燥后, 称总质量并放入马弗炉中, 450 ℃锻烧3 h；冷却后移至离心管中, 加入20 mL 3.5 mol·L^-1盐酸, 加盖摇匀；振荡16 h, 离心提取总磷, 测得总磷量与冻干燥后泥样的质量比, 即为生物膜磷含量.

2.5 微生物种群分析 2.5.1 污泥样本和DNA提取

本实验所用的样品均取自生物膜反应器, 污泥样品分别为每个批次进行前后的泥样.获得活性污泥样品后, 在14000×g下离心2 min, 去除上清液, 80 ℃保存, 用试剂盒(Fast-DNA-Spin-kit-forsoil, MP, USA)提取DNA.用纳米滴分光光度计(ND-1000, Thermo Fisher Scientic, USA)测量提取的DNA的核酸浓度和纯度, 并使用1%琼脂糖凝胶电泳评估提取的质量(Ma et al., 2015).

2.5.2 SEM-EDS

将泥样放置在2.5%戊二醛溶液中, 在室温4 ℃下固定过夜, 用乙醇溶液脱水处理后再用丙酮处理, 将包埋剂与丙酮的混合液按照1:1的比例处理样品3 h, 最后用包埋剂处理样品, 70 ℃加热过夜.样品用Reichert超薄切片机切片, 获得70~90 nm的切片后用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min.最后用FEI2500型扫描电镜观察(Tian et al., 2016).

2.5.3 高通量测序

用特异性正向引物519F (CAGCMGCCGCGGTAATW)和反向引物907R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)扩增细菌16S rDNA的V3~V4区.PCR体系采用25 μL的反应体系, 包括2.5 μL 10×Buffer、2 μL dNTP、2 μL DNA模板、引物各0.5 μL(10 μmmol·L^-1)、0.5 μL Taq酶和17 μL无菌水.PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s, 54 ℃低温退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环；72 ℃最终延伸10 min后形成扩增产物, 扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测.将DNA样品于-20 ℃下冷冻保存, 而后将DNA样品送出, 采用Illumina MiSeq测序仪进行PE 300测序.

2.5.4 测序数据的后处理

离线数据按照每个样本的条码序列进行拆分, 拆分过程中不允许条码不匹配.单样本的双端测序结果用FLASH进行拼接.对剪接结果进行质量控制, 用Uparse方法去除平均质量分数小于30的序列, 去除嵌合序列.利用Uparse对序列进行聚类, 相似度为0.97, 并用Uclust方法将代表性序列与Silva数据库进行比较, 进行物种注释.为了避免采样效率对微生物群落分析的影响, 根据每个样品中的最小序列数随机抽取每个样品的序列数.随机抽样结果用于下游物种丰富度比较、α多样性和β多样性计算等生态统计分析.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 BSBR工艺性能

BSBR反应器在溶解氧3.5 mg·L^-1下稳定运行65 d, 运行效果如图 2所示.经过20 d的培养稳定后, 磷去除率保持在85%以上, 出水磷浓度可达0.5 mg·L^-1以下, 随着外界回收液磷浓度不断升高, 好氧出水水质出现了波动, 且回收液磷浓度上升缓慢, 当好氧出水磷浓度大于1 mg·L^-1时判定此时BSBR工艺在该运行工况下取得最佳运行效果并更换厌氧回收液, 使其磷浓度从0 mg·L^-1重新进行富集(第23、39、47、64 d分别更换了磷回收液).如图 2a所示, 回收液磷浓度上升都呈现出较为明显的周期性, 更换回收液后, 系统的除磷率恢复正常, 正常运行周期内的磷去除率稳定在85%左右, 出水磷浓度均能稳定在1 mg·L^-1以下.该系统可用0 mg·L^-1的好氧投加碳源和200 mg·L^-1的厌氧投加碳源, 获得浓度最高达115 mg·L^-1的可溶性磷回收液.由表 2可知, 该系统具有一定的优势, 系统的平均磷(可溶性磷)回收率为40.7%.

C_upt/P_rel表示释放单位质量磷的COD消耗量, 即一个厌氧周期内碳源消耗量与磷释放量之比, 是衡量经济技术可行性的直观指标之一.传统EBPR的C_upt/P_rel研究认为, 导致PAOs生长优于GAOs生长的因素有：pH＞7.25, 温度＜25 ℃, C:P= 10~25 mg·g^-1, 碳源的种类及碳源的投加方式(Oehmen et al., 2007; Tu et al., 2013).基于生物膜磷回收法中, 针对C_upt/P_rel的研究相对较少, 但随着循环周期的增加, 厌氧回收液磷浓度升高时, 生物膜面对高外界磷浓度的释磷阻力会增大, C_upt/P_rel理论上会阶段性的逐渐超过传统的活性污泥法.BSBR工艺的C_upt/P_rel经过培养稳定期后, 运行阶段平均保持在(11.12±1.03) mg·mg^-1(图 2b), 与Panswad等(2011)的研究中当溶解氧为3.0~3.5 mg·L^-1, 进水磷浓度从6 mg·L^-1增加至10 mg·L^-1时, C_upt/P_rel从14.28 mg·mg^-1降低至10 mg·mg^-1的水平相当.说明在该系统面对外界高浓度释磷阻力时, 碳源消耗水平并未受到严重影响.

3.2 碳源浓度对BSBR工艺释磷的影响

在第25 d好氧阶段结束后, 将反应器中填料取出, 在六联搅拌机中模拟初始水力条件(2.2节)进行批次厌氧释磷实验.分别设置3组COD(200、500、1000 mg·L^-1)及两组外界磷浓度梯度(0、70 mg·L^-1)共6组实验组, 结果如图 3所示.在图 3a的实验中, 2 h内释磷量分别为24.7、33.18、43.33 mg·L^-1, 释磷速率分别为12.35、16.59、21.67 mg·L^-1·h^-1, 说明提高碳源投加量可以刺激磷的释放量和释放速率, 但同时COD为200、500、1000 mg·L^-1下的C_upt/P_rel分别为7.36、8.3、10.4 mg·mg^-1, 说明提高碳源并不是种经济的选择.在图 3b的实验中, 2 h内磷释磷量分别为7.25、8.75、13.2 mg·L^-1, 释磷速率分别为3.63、4.375、6.6 mg·L^-1·h^-1, C_upt/P_rel分别为25.07、27.68、40.18 mg·mg^-1.这说明磷回收工艺与传统磷回收工艺之间最大的不同在于：磷回收工艺面临一个渐增的外界释磷压力, 外界磷浓度越高, 释磷速率和释磷量越低, 磷释放消耗的能量越高.碳源是影响磷回收工艺的一个关键因素, 但随着外界磷浓度提升, 碳源的需求增量呈现非线性增长, 碳源并非经济的刺激释放选项.

3.3 碳源投加方式对BSBR工艺释磷的影响

为了进一步研究不同的碳源投加方式对BSBR系统释磷效果的影响, 设计了两种碳源投加方式, 分别为一次投加200 mg·L^-1碳源和分两次在厌氧初期和1 h时各添加100 mg·L^-1碳源, 分别对比两种投加方式的厌氧释磷量和C_upt/P_rel, 结果如图 4所示.在两组不同回收液磷浓度条件下, 分批投加的效果均优于一次投加.图 4a中分批投加和一次投加碳源的2 h释磷速率分别为12.35和12.3 mg·L^-1·h^-1, 2 h内的释磷速率并无明显区别；图 4b中也呈现相同的规律, 但在5 h的厌氧释磷时间内, 分批投加碳源的磷释放量比一次投加多.此外, 两组实验的C_upt/P_rel对比中, 分批投加碳源的C_upt/P_rel在几乎所有时间段内都要低于一次投加, 说明分批投加碳源可以优化系统的碳消耗, 在足够的停留时间内, 释磷效果要优于一次投加.但对比发现, 分批投加碳源的平均释磷行为时间大约是3 h, 而一次投加基本完成释磷行为的时间约2 h, 厌氧周期短33%左右, 这意味着提高碳源利用率的代价是需要延长厌氧停留时间, 在将来的工程应用方面, 短的周期意味着同样体积的反应器可以承载更大的负荷或是同样负荷可以缩小占地.

3.4 蓄磷量对厌氧释磷效果影响

图 2b中显示, 系统的C_upt/P_rel并非一直随着外界磷浓度上升而上升, 在多个周期内, 外界磷浓度较高时, C_upt/P_rel均有一定的下降趋势, 说明BSBR并非一个单碳源影响系统.BSBR工艺中想要获得高磷浓度的回收液, 势必要考虑高外界磷浓度阻力下释磷的能源消耗.随着回收液中磷浓度升高, 需要更多的能量充当释磷推动力, 厌氧阶段, 聚磷菌的能源主要来自于体内聚磷(Poly-P, PP)的水解.高碳源可以刺激磷释放的原因可能在于刺激聚磷菌中PP水解更彻底, 从而获取更多能量去吸收并转化碳源, 随着聚磷菌胞内正磷酸浓度升高, 面对外界高浓度磷进行跨膜运输时的消耗也会相应减少.Tian等(2016)通过厌氧投加高碳源培养出来的生物膜具有较高的蓄磷量(150 mg·g^-1), 高于传统活性污泥法中的40~50 mg·g^-1(Ahn et al., 2001).提升生物膜中蓄磷量的方式, 除了厌氧段投加高浓度碳源外, 还可以强化好氧段的吸收, 因此, 猜想若通过碳源刺激以外的方式达到增加生物膜蓄磷量的效果, 是否可以在厌氧低碳源投加下获取高浓度磷回收液.在开展强化蓄磷量试验之前需对现行BSBR工艺中, 蓄磷量对厌氧释磷效果进行量化研究.

在回收液浓度处于不同浓度时取泥样并测定初始磷含量, 并将悬浮填料平分两份, 保持40%的填充比, 在碳源浓度分别为200 mg·L^-1和1000 mg·L^-1的两组回收液中同时进行2 h的厌氧释磷实验, 观测不同蓄磷量下的磷释放量, 结果如图 5所示.厌氧释磷量随生物膜内初始蓄磷量(以每g MLSS中的P计)的增大而增大, 当磷含量从67.4 mg·g^-1上升至124 mg·g^-1时, 在2 h厌氧停留时间内, 200 mg·L^-1碳源投加量的情况下, 释磷量从22.58 mg·L^-1上升至28.61 mg·L^-1, 与此同时, C_upt/P_rel呈下降趋势, 这表明高浓度碳源并非刺激厌氧磷释放的唯一手段, 在生物膜磷回收工艺中, 提升蓄磷量也可以突破由外界渐增磷浓度所带来的释磷阻力且同时优化系统的碳消耗.

图 5同时也对比了两种碳源梯度的释磷效果, 在相同的释磷时间内, 高度碳源组的C_upt/P_rel均随着蓄磷量的提升而下降, 说明提升蓄磷量确实可以优化系统的碳源消耗, 同时对比发现, 高碳源可以刺激系统在厌氧阶段释磷, 但取得相同磷释放量的情况下, 碳源的消耗代价大约是4倍左右.提升生物膜蓄磷量可以从好氧吸磷能力角度选择强化, 影响因素主要有好氧进水磷浓度、好氧停留时间等.后续研究将对不同的提升蓄磷量的方法进行量化研究并比较相应的经济可行性.

3.5 BSBR工艺的微生物群落分析

分别取第0 d、65 d的泥样在门水平上对物种丰度大于1%的微生物进行分析, 结果如图 6a和6b所示.经过培养, BSBR系统的Proteobacteria得到富集, 从一开始的33.67%上升至64.41%.研究表明(Zilles et al., 2002), 大部分聚磷菌属于变形菌门, 变形菌门的强化体现出除磷效果的强化.同时, Cholriflexi从18.29%下降至4.25%, 说明BSBR磷回收工艺微生物群落的筛选发生了变化.

取相同的污泥样品在属水平上对物种丰度大于2%的微生物进行分析, 结果如图 6c和6d所示.由图可知, Competibacter、Saprospiraceae、Rhodocyclaceae和hydrogenophaga的数量发生了明显的变化.其中, Rhodocyclaceae被认为是聚磷菌的一种, 其含量由初始阶段的1.04%上升至10.02%, 聚磷菌丰度虽然较低, 但整体运行磷回收效果较好.此外, 系统内的聚糖菌由初始的1.42%上升至18.74%.传统EBPR除磷机制表明, GAOs和PAOs存在营养竞争关系, 强化除磷的本质是抑制GAOs, 促进PAOs生长, 但在本悬浮填料生物膜磷回收系统中, 在本不利于GAOs竞争的环境下(低进水碳磷比、相对低温度、低碳源), GAOs的丰度却超过PAOs且系统的磷回收性能并没有因此受到影响.文献表明(Acevedo et al., 2012), PAOs在Poly-P含量较低时会从聚磷模式(Polyphosphate-accumulating metabolism)转化成聚糖模式(Glycogen-accumulating metabolism), 由此猜测, 在BSBR系统运行模式中, 可能存在逆转换的现象, 具体将在后续研究中深入求证.

4 结论(Conclusions)

1) BSBR系统稳定运行65 d内, 磷回收有明显的收割周期, 整体系统的磷去除率达到85%以上, 在好氧无碳源投加、厌氧200 mg·L^-1乙酸钠碳源投加情况下, 取得了最高115 mg·L^-1的可溶性磷回收液, 系统的C_upt/P_rel平均为(11.12±1.03) mg·mg^-1.

2) 在厌氧释磷批次实验中, 获得磷释放效果与初始碳源投加量、外界磷浓度及蓄磷量之间的量化关系, 系统的C_upt/P_rel随着初始蓄磷量的增加而变小, 随着碳源投加量的增加而变大.厌氧分批投加碳源相比一次投加碳源的方式可以刺激释放更多的磷且优化系统的C_upt/P_rel, 但在本BSBR系统中, 厌氧停留时间需由2 h延长至3 h.

3) 厌氧投加高浓度碳源刺激可以提升磷回收液浓度, 但并不经济, 提升蓄磷量也是刺激厌氧有效释放的有效手段, 且可以减少BSBR释磷对碳源的消耗量.

4) 在好氧进水无碳源、厌氧200 mg·L^-1的碳源投加模式下, 培养出的生物膜中聚磷菌得到有效的筛选富集, Proteobacteria(变形菌门)从一开始的33.67%上升至64.41%.