1 引言(Introduction)

随着科技的发展、经济的腾飞和人口的增长, 污水排放量也不断增加, 污水处理量及后续处理成本增加等问题也相继而来, 目前, 剩余污泥产量大已成为最严重、最突出的一类问题(任宏洋等, 2019；董春娟等, 2019).由于剩余污泥中含有大量的蛋白质、多糖等可降解有机物, 如果这些污泥得不到妥善有效的处理处置, 既造成环境污染也导致资源浪费(胡德秀等, 2019).一般来说, 厌氧消化是减少和稳定剩余污泥的重要途径之一.剩余污泥通过厌氧发酵或者消化来生产短链脂肪酸(SCFAs)、氢气和甲烷等产物(王洋涛等, 2019).目前来说, SCFAs被认为比甲烷和氢气更有价值, 因为SCFAs可以作为废物衍生的羧酸盐平台, 用于合成各种用途的更有附加价值的产品(如生物降解塑料、生物柴油), 或作为废水反硝化的补充碳源(Jin et al., 2017；Huang et al., 2018).

污泥厌氧消化作为污泥处理的方法之一, 具有环境友好和经济吸引力. SCFAs作为厌氧消化的中间产物之一, 具有较高的经济价值, 但在当前污泥厌氧发酵工艺中, 污泥有机物的分解率和生物转化效率低等问题使得SCFAs的实际产量受到限制.但应该看到, 通过改进工艺和技术, 污泥厌氧发酵生产SCFAs的潜力较大.为了进一步提高SCFAs产量, 解决厌氧发酵水解率和酸化率低的问题, 很多研究者认为可以采用预处理方式改善污泥厌氧发酵过程.例如, 采用碱处理、超声处理、热处理等多种预处理技术, 促进污泥分解, 加速污泥的生物降解过程(吕景花等, 2019；刘伟等, 2019; 王磊等, 2019；Jeong et al., 2019).或者针对发酵本身的特性, 利用不同的添加剂(如nZVI、钢渣等)通过促进水解和产酸过程来提高SCFAs的产量(王攀等, 2019；Kim et al., 2019).但这些处理方式都有一定的局限性：预处理技术虽然应用广泛, 但在实际工程中经济性较差；而合成复杂、排放过程中容易丢失的纳米工程材料, 以及未经仔细检测可能会带来重金属元素的炉渣, 都使污泥后续相关处理难度增加.与上述改善厌氧发酵过程的方式不同, 采用污水处理中常用的填料(如有机聚乙烯、无机页岩陶粒等), 以培养生物膜的方式增加污泥厌氧发酵过程中的生物量, 具有无害且便宜的优点.聚乙烯(PE)和页岩陶粒(SC)等载体作为生物膜支撑材料在废水处理中被广泛研究(赵桂瑜等, 2007；Gong et al., 2019).据报道, 在厌氧膜生物反应器中, 圆柱状聚乙烯PE载体富集水解细菌, 促进细菌、酶和底物之间的相互作用, 有利于颗粒水解(Zheng et al., 2019).然而, 利用填料改善污泥厌氧发酵生产SCFAs的性能的文献报道较少.

本研究旨在探讨有机聚乙烯(PE)和无机页岩陶粒(SC)两种填料对污泥厌氧发酵过程中污泥溶胞过程及SCFAs产量的影响, 通过考察污泥中溶解性有机物、SCFAs总量和组成及细菌群落结构的变化, 探讨填料在厌氧发酵中的作用.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 污泥和填料的来源及性质

本研究采用的剩余污泥取自北京永丰污水处理厂的脱水污泥, 新鲜的脱水污泥在试验前放于冰箱4 ℃贮存, 使用前将污泥溶解在去离子水中, 使挥发性固体(VS)的浓度大约为14 g·L^-1, 总固体(TS)浓度为21.8 g·L^-1.随后将稀释的原污泥pH值调为9, 然后在90 ℃的水浴条件下预处理60 min(Yuan et al., 2006；蒋昌旺, 2019).接种污泥来自于实验室厌氧发酵罐.

本实验研究了两种不同的填料—有机聚乙烯(PE)和无机页岩陶粒(SC).单个反应器内PE和SC的填充量分别为2.5 g和50 g, 在体系中填料体积与反应器有效容积的比例大约是20%, 两种填料在反应器的空隙率分别为90%和58%.此外, PE呈圆柱状, 直径为10 mm, 密度为0.96 g·cm^-3, 具有良好的化学稳定性, 无毒无味, 吸水率低, 耐水性好.SC呈碎石型, 粒径为3~5 mm, 密度为0.3~0.5 g·cm^-3, 比表面积为3900 m²·m^-3, 其化学成分主要为SiO₂(59.00%)、Al₂O₃(18.20%)、Fe₂O₃(7.79%)、MgO+CaO(2.54%+2.86%)、K₂O+Na₂O(2.95%).

2.2 试验运行过程

厌氧发酵试验在恒温振荡培养箱中进行, 每组试验各做两组平行.首先将底泥和接种泥分别装至6个500 mL的锥形瓶中, 每个瓶中装400 mL底泥、40 mL接种泥；其次将PE和SC以给定的比例(20%)分别装入其中的4个锥形瓶中, 两个空白组作为对照；然后将锥形瓶通入氮气5 min去除溶解氧, 接着盖上盖子并密封；最后将6个瓶子置于恒温振荡器中, 中温35 ℃、160 r·min^-1下厌氧发酵.每天用4 mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值为9.锥形瓶中pH从调节后的9逐渐下降到8.6, 然后调节为9.

发酵持续10 d, 每天取样, 样本取出后立即经离心机10000 r·min^-1离心10 min, 再经0.45 μm孔径的有机系膜过滤后, 取滤液测SCOD、NH₄⁺、多糖和蛋白质等指标.此外, SCFAs样品需要进一步采用0.22 μm有机系膜过滤.在发酵的最后一天测定微生物群落.

2.3 检测方法

TS、VS、NH₄⁺、SCOD按标准方法测定(APHA, 1998).蛋白质测定采用Lowry-Folin法, 多糖测定采用蒽酮-硫酸法(Lowry et al., 1951；Somani et al., 1987).SCFAs样品使用气相色谱仪(GC-2010、日本岛津)检测.污泥粒度分布使用激光粒度分析仪(Mastersizer 3000, Malvern, UK)测量.

2.4 焦磷酸测序及分析

本实验采用16S RNA高通量法测定微生物群落结构.在第10 d收集污泥样品, 立即置于-20 ℃的冰箱中保存, 然后送至Allwegene Co., Ltd.(Beijing, China)进行高通量测序.

采用PowerSoil DNA隔离试剂盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, USA)进行DNA提取.提取基因组DNA后, 用电泳(1%琼脂糖凝胶)和分光光度计检测基因组DNA, 并在-20 ℃下保存, 待进一步研究.然后采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′)/806R(5′-GGACTACNNGGG TATCTA AT-3′)扩增16S rRNA基因片段的V3~V4区.

PCR产物采用美国Promega公司的QuantiFluor-ST蓝色荧光定量系统进行定量.根据所有样本的测量要求, 进行相应比例的混合, 构建一个复合测序库.然后在Illumina Miseq PE300平台(Illumina, San Diego, USA)上对得到的文库进行配对测序.最后, 除长度为230 bp外, 每个样本的序列编号都列在表中.每个样本的菌株序列按门、纲、目、科、属或种进行分类.利用Usearch(v10.0.240)识别97%的OTUs序列, uparse可以对有效序列进行聚类.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 填料对污泥颗粒粒径的影响

发酵结束后(第10 d)污泥的粒径大小分布如图 1所示, 可将污泥颗粒分成3个部分：小颗粒(1~10 μm), 几乎相当于细菌细胞的大小；中间颗粒(10~100 μm), 与之对应的是细菌和小颗粒污泥的聚集体；大颗粒(100~1000 μm), 这可能是未破裂的大型污泥絮体.从图 1c中可以看出, PE和SC组的小颗粒和中间颗粒的体积分数均高于对照组, 大颗粒的情况正好相反.图 1b所示为污泥粒径的累积分布频率分别为10%、50%和90%时污泥颗粒的当量直径, 可以看出PE和SC组的污泥颗粒粒度均小于对照组.

污泥颗粒的分解是污泥溶解的第一步, 是污泥由大颗粒变成小颗粒甚至单个细菌细胞的转变.因此, 污泥颗粒粒径是反映污泥分解的一个重要指标.有文献指出, 良好的污泥分解有利于加速剩余污泥的分解, 并促进后续SCFAs的生产(Wang et al., 2019).由图显而易见, PE和SC的加入促进了大型污泥颗粒的分解, 这有利于后续的溶胞、水解和产酸.且已有文献证明, 与大颗粒相比, 具有更好的表面-体积比的小颗粒水解得更快(Chen et al., 2018).PE和SC试验优于对照试验, 可能是由于发酵罐中的PE和SC使污泥颗粒受到了生物膜载体与污泥颗粒之间摩擦所产生的更大的剪切力.较小的污泥颗粒和较大的比表面积会促进污泥发酵.类似的结果在之前的城市固体废物和初级污泥的文献中也有报道, 例如, Esposito等(2011)对0.0025~0.05 m范围内不同PS的城市生活垃圾进行调查, 结果表明, 随着垃圾PS的增加, COD降解率降低, 产甲烷量随之降低；Wang等(2020)研究发现, 高搅拌速度能够引起初级污泥的解体, 即在G = 160 s^-1下污泥颗粒粒径从53.4 μm下降到44.6 μm, SCOD和SCFAs浓度分别增加8.3%和9.5%.综上表明, 添加PE和SC可以使污泥分解更完全, 这在一定程度上会加速污泥的溶胞阶段, 是污泥发酵的限速步骤.

3.2 填料对污泥中溶解性有机物的影响

污泥溶胞是污泥由微粒转变为可溶物质的过程, 是厌氧发酵过程中的限速步骤(Chen et al., 2017).污泥溶胞的程度可以由SCOD、可溶性多糖、可溶性蛋白和氨氮来表示(Xu et al., 2017).具体来说, 在厌氧发酵的早期阶段, SCOD可能是污泥细胞分解的产物, 这是一个不需要微生物或酶参与的物理过程.随着发酵的持续进行, SCOD开始逐渐包含更多的水解产物, 如溶解性多糖、溶解性蛋白质和SCFAs等.多糖和蛋白质与水解过程有关, 而SCFAs与产酸过程有关.

图 2为各发酵罐中SCOD、溶解性多糖、溶解性蛋白质和氨氮浓度随时间的变化情况.如图 2a所示, 发酵开始时, 大量的有机物开始释放到溶液中, PE组SCOD从第1 d的4776 mg·L^-1迅速上升到第9 d的6268.5 mg·L^-1, 其最大浓度是对照组的1.3倍.而SC组的SCOD与之相似, 从第1 d的5131 mg·L^-1上升到第6 d的5583 mg·L^-1, 是对照组的1.02~1.07倍, 随后开始出现下降趋势, 这可能与后续水解过程有关.对照组的SCOD一直低于PE和SC组.由此可见, PE和SC的加入对污泥的水解都有促进作用, 但PE的促进作用大于SC.一般而言, 污泥中测得的SCOD越大, 寿命污泥中产酸菌可利用的有机物也越多, 后续获得的产物也越多(潘维等, 2011).由图 2b和2c可知, 3组试验中溶解性蛋白质与SCOD的结果大不相同, 蛋白质含量均在第2 d最高, PE组为1048.48 mg·L^-1, SC组为997.01 mg·L^-1, 对照组为1009.8 mg·L^-1.自此之后直到第10 d, 各组蛋白质含量都显著下降.在厌氧发酵的第3~5 d内, PE和对照组的蛋白质含量高于SC组, 又从图 2a可以看出, 厌氧发酵第3~5 d PE组的SCOD高于SC组, SC组略高于对照组, 这可能是由于SC将有机物转化为蛋白质和多糖的能力低于PE, 而SC将蛋白质和多糖转化为SCFAs的能力高于对照组.在厌氧发酵的第5~7 d, PE和SC组的SCOD都低于对照组, 此时, 系统处于厌氧发酵后期, 在填料的作用下蛋白质和多糖转化为SCFAs的能力增强.相比较于蛋白质, 溶解性多糖与SCOD的变化情况类似, PE和SC组的溶解性多糖含量都高于对照组, 且3组都呈先升高后趋于平缓的变化趋势.研究结果表明, 污泥颗粒转化为蛋白质和碳水化合物的过程是污泥溶胞的第一步, PE可能促进SCOD向蛋白质和多糖转化, 但SC只促进SCOD更多的向多糖转化；而后, 厌氧发酵过程中的蛋白质和多糖被水解为小分子化合物(如氨基酸和单糖), 并被产酸细菌利用生成SCFAs, 使蛋白质浓度不断下降.而蛋白质与多糖的不同, 可能是由于在污泥厌氧发酵过程中, 污泥蛋白质是产酸发酵的主要底物来源(陈兴春等, 2015).研究表明, 污泥厌氧发酵过程中蛋白质水解可释放出氨(或铵)(Zhang et al., 2019).从图 2d可以看出, 在整个发酵过程中(第1~10 d), PE、SC和对照试验中释放的氨氮保持稳定(约425 mg·L^-1).考虑到可溶性蛋白浓度自第2 d开始下降, 可以推测部分氨氮可能被细菌利用进行合成代谢.PE和SC两组的氨氮仍然略高于对照组, 这与SCOD和多糖的浓度分布一致.

3.3 填料对污泥厌氧发酵产酸的影响

图 3a反映了不同填料下SCFAs总量随发酵时间的变化情况.总SCFAs(TSCFAs)的变化趋势与3.2节中SCOD的变化趋势相似, 在PE和SC试验中总SCFAs浓度从第1 d开始增加到第7 d, 然后开始下降, 直到发酵结束.总SCFAs浓度在PE和SC两组试验中最高浓度分别为2538.26 mg·L^-1和2379.90 mg·L^-1, 分别为对照组的1.2和1.1倍.PE和SC两组试验中总酸浓度在发酵中后期(第6 d以后)有明显的变化, PE的加入使TSCFAs浓度保持在2000 mg·L^-1以上, 相较PE而言, SC的加入使TSCFAs浓度有一个明显的下降趋势, 甚至下降至1481 mg·L^-1, 比对照组(1456 mg·L^-1)略高.鉴于本研究主要是碱性发酵, 故产甲烷微生物的活性很低, 不做考虑.因此, SCFAs浓度在第7 d出现下降的主要原因是SCOD(特别是蛋白质)的损耗, 其峰值出现在第7 d, 表明PE或SC组的最优污泥停留时间(SRT)出现在第8 d或第7 d, 相较之前的研究缩短了SRT(Li et al., 2018).而对照试验中, SCFAs总浓度从第5 d开始下降, 比前两组试验提前2 d.这一现象表明PE和SC都可以促进污泥的溶胞, 因为更彻底的污泥溶胞可以提供更多的初级底物, 如蛋白质和多糖, 使SCFAs的生产更加持久.此外, 在VS的降解上也体现了加入PE和SC的优势, 通过试验结果可以看出, PE和SC组有机物的降解能力较好, 分别达到29.7%和29.1%, 对照试验为24.9%, 这也是导致SCFAs的生产更加持久的原因之一.

图 3b~3d描述了不同填料下SCFAs产量及组分随时间的变化情况.从图中可以看出, 总SCFAs被分成了6个独立的短链脂肪酸, 即乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸, 且乙酸含量在总酸中占比最高, 达到50%~60%, 其次是丙酸, 占12%~20%, 丁酸和戊酸(包括异丁酸和异戊酸)共占20%~38%, 相同的结果也在之前的其他研究中有报道(Liu et al., 2019).在PE组中, 这6种单酸的含量是3组试验中最高的, 乙酸含量在前7 d迅速增加, 在达到1450.68 mg·L^-1之后开始下降并稳定在1200 mg·L^-1；丙酸、异丁酸和异戊酸的变化趋势与乙酸相同, 其含量从第1 d的225.99、142.35和190.65 mg·L^-1分别上升至第7 d的409.29、187.29和243.15 mg·L^-1, 然后出现略微下降；丁酸和戊酸与其他4种单酸不太相同, 它们在前5 d缓慢上升, 然后迅速下降, 丁酸含量甚至达到0 mg·L^-1.SC组与PE组的情况大致相同, 但SC组中6种单酸的含量都略低于PE组, 对照组6种单酸的变化趋势与前两组试验相同, 但其含量是3组试验中最低的, 到发酵后期, 对照组的异丁酸和异戊酸含量都下降至0 mg·L^-1.结果表明, 厌氧发酵的中间产物SCFAs在发酵中期(第6~7 d)大量积累, 而且PE和SC的加入促进了污泥中可溶解性的有机物更多的向各类单酸转化, 发酵后期对照组的丁酸和戊酸均消失, 而添加了PE和SC的试验中, 丁酸和戊酸还依然存在, 表明填料可能在发酵中避免丁酸和戊酸向乙酸的降解.

3.4 填料对污泥厌氧发酵过程中细菌群落的影响

一般认为厌氧污泥发酵的水解酸化过程主要是在细菌的作用下完成, 细菌是将污泥中复杂有机物向小分子有机物及SCFAs转化的重要工具.为了深入研究填料在SCFAs生产的作用, 对3组发酵试验的细菌群落进行了采样和分析.

图 4所示为Shannon-Wiener曲线, 它是反映样品物种多样性的指标.曲线变平, 说明测序数据量足以反映样本中绝大多数物种信息.从图中可以看出, 3组实验的测序都是真实可靠的.此外, Shannon指数越高, 代表物种多样性越多, 对照组的多样性大于PE组, PE组大于SC组, 说明填料的加入减少了微生物的多样性, 增加了优势菌富集的可能性.图 5a所示为不同样本在门水平上细菌群落的变化.在3组试验中, 厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)是优势菌门(王晓华等, 2016), 但其相对丰度在各组试验中有很大的差别.具体来说, 就Proteobacteria的相对丰度而言, PE和SC组分别为30.7%和32.6%, 几乎是对照组(11.2%)的3倍.显然, 在碱性发酵试验中, PE和SC的添加有利于Proteobacteria的繁殖增长.以往的研究表明, Proteobacteria中有一些细菌可以将蛋白质和多糖等有机化合物转化成乙酸等产物(Luo et al., 2016).另外两个门Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度与Proteobacteria完全相反, PE和SC组中这两个门的相对丰度较对照组都出现下降, 不同的是, PE组Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度分别从38.6%和40.2%下降至27.2%和37.2%.而SC组Firmicutes的相对丰度从38.6%下降至33.3%, Bacteroidetes的相对丰度从40.2%下降至22.8%.据报道, Firmicutes和Bacteroidetes中的某些细菌具有产生利用SCFAs的酶合成其他物质的能力(Ariesyady et al., 2007).因此, PE和SC的加入增加了产酸菌(Proteobacteria)的富集, 并且Firmicutes和Bacteroidetes的减少对SCFAs的合成也是有利的.从图 3a中TSCFAs的结果可以看出, PE组的TSCFAs浓度高于SC组, 在Proteobacteria水平上, PE组和SC组的差别不明显, 在Firmicutes的相对丰度上, PE组比SC组下降的更多, 在Bacteroidetes的相对丰度上, SC组比PE组下降的更多, 这可能是两者SCFAs产量出现差异的主要原因之一.

为了进一步探究PE和SC对污泥厌氧发酵中SCFAs产量造成的差异, 本文研究了每个样品在属水平上的分布, 结果见图 5b.由图可见, 3组试验中属水平的相对丰度差别很大.在Proteobacteria门水平上, 该门中的Brachymonas属是本实验中能确认的丰度最大的属类, 在PE组中最高为17.3%, 其次为SC组的7.0%, 对照组中为2.1%.而该门中的另一个菌属—Pseudomonas属在SC中的相对丰度为15.35%, 可以认为是第二菌属, 在PE组和对照组中的相对丰度分别为0.1%和0.9%.这与SCFAs的结果相似, Brachymonas属在PE组中丰度最大, Pseudomona属在SC组中丰度最大, 且Brachymonas属的丰度大于Pseudomona属, 这是造成PE组的SCFAs产量高于SC组的原因之一.此外, 也可以看出Brachymonas属和Pseudomona属均为发酵细菌, 主要发酵易降解的蛋白质和多糖等有机化合物产生乙酸.另外几个相对丰度较高的菌属在Bacteroidetes门上, 其中, Anaerophaga属(15.2%)和Cytophaga属(10.4%)在对照组中偏高, 而在PE组分别为14.9%和0.7%, 在SC组中分别为9.2%和0.6%, 都低于对照组.由于Anaerophaga属是利用戊酸合成其他物质的一类微生物, Cytophaga属可以产生大量的活性酶.因此, PE和SC的加入可以增加SCFA种类的多样性, 与图 3b~c的结果一致.以上结果表明, 厌氧发酵中SCFAs的生产与系统中微生物的变化息息相关.

4 结论(Conclusions)

在污泥厌氧发酵体系中, PE和SC的加入可以提高污泥的分解和水解能力, 产生更多可利用的基质, 减少微生物的多样性, 富集产酸微生物, 进一步促进TSCFAs的积累.无论填料类型如何, 其加入都增加了SCFAs的多样性, 这可能与Anaerophaga属和Cytophaga属的减少有关.此外, PE组中Brachymonas属的相对丰度最大, 高于SC组中Pseudomona属的相对丰度, 这可能是PE组的SCFAs产量高于SC组的主要原因之一, 也说明合适的填料能够富集产酸优势菌群.