1 引言(Introduction)

邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate acid esters, PAEs)是邻苯二甲酸酐与醇经酯化反应得到的、世界上生产量最大的一种人工合成有机化合物, 属于化学激素类物质.PAEs作为塑料制品的增塑剂, 具有易加工、可降低聚合物粘度、增加柔韧性的特点, 被广泛应用在医用塑料制品、建筑涂料、化学材料、食品加工设备中(Net et al., 2015).由于PAEs类增塑剂和塑料基质分子没有通过共价键, 仅是由氢键和范德华力相互连接, 因而各个分子间保持独立的化学性质, 导致PAEs很容易逸出塑料并转移到外界, 从而对农业土壤、水域水源和大气等环境造成污染(崔学慧等, 2010).同时, PAEs也会通过食物链传递, 在高营养级生物体内甚至人体内富集, 从而对动物及人体健康造成影响.邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种分布广泛的内分泌干扰物, 作为PAEs中对水生生物表现毒性作用的主要物质, 已被美国环保局(US EPA)列为优先控制污染物, 被欧盟列为第2类生殖毒性化合物, 且我国也将DBP列入环境优先控制污染物黑名单(Autian, 1973; Staples et al., 1997; 李蕾等, 2014).目前, 我国多个河流、湖泊及城市饮用水中检出的PAEs浓度已超过地表水环境质量标准(PRC-NS GB 3838-2002)和饮用水质量标准(PRC-NS GB 5749-2006).然而在国内人群摄入DBP相关调查中发现, 其最主要的摄入途径是进食与饮水, 且现在普及的净水设备无法完全去除饮水中的DBP, 因此, PAEs的潜在影响备受关注.

目前, 有关DBP对生物的毒性研究对象包括水生生态系统中的鱼类、软体动物和藻类.其中, 藻类和鱼类的研究最多(孙翠竹等, 2016), 包括藻类对环境中污染物的降解, 以及鱼类在污染物影响下生理功能和生殖系统的受损.对浮游动物的毒性效应研究则是重点关注不同浓度DBP对生物种群增长变化影响, 例如, 研究表明, 0.50 mg·L^-1的DBP对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)的种群增长与对照组差异不大(Zhao et al., 2009)；DBP对多刺裸腹溞(Moina macrocopa)净生殖率和总繁殖率等无显著影响(王金霞等, 2009)；4 mg·L^-1以下的DBP对大型溞(Daphnia magna)的生长影响不显著, 但对繁殖影响显著(黄国兰等, 1998).但大多数毒性研究仍然集中于讨论多代生物毒性影响, 有关亲代对后代生物残留的毒性影响研究还不充分.

蒙古裸腹溞是一种在海水中驯化成功的盐水枝角类, 作为一种极具开发利用潜力的生物饵料, 在海水经济动物养殖中被广泛应用.且蒙古裸腹溞的敏感性较强, 是毒性试验中良好的试验材料, 作为海洋污染的测试生物之一, 具有良好的应用前景.在毒性研究方面, Wang等(2018)研究了蒙古裸腹溞暴露于Cd²⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的生态毒理效应；石婷婷(2017)研究了蒙古裸腹溞暴露于Li⁺的毒性效应；鞠哲(2016)和魏海峰等(2007)研究了有机溶剂对蒙古裸腹溞毒性效应.基于此, 本试验拟探讨DBP对蒙古裸腹溞的急性毒性及生殖毒性效应, 重点研究仅有亲代在毒性环境下, 亲代及后续世代蒙古裸腹溞(Moina mongolica)的种群生长, 以期为DBP对枝角类的慢性毒性效应研究提供基础数据, 并为评价DBP对环境的生态风险提供参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料

试验所需的蒙古裸腹溞来自辽宁省水生生物学重点实验室, 系大连海洋大学经海水驯化成功并在试验室条件下培养多年, 经多代的孤雌生殖得到稳定遗传的种系, 在海水中可正常繁殖生长.试验挑选一只健壮的雌溞进行孤雌生殖, 而后将母溞取出, 对幼溞单独培养, 直至得到试验所需的同步幼溞(日龄 < 12 h).

试验所需的海水来自辽宁省大连市黑石礁附近海域, 先经砂滤, 再用300目的绢网过滤并煮沸消毒后, 稳定3 d, 海水盐度为30‰±0.5‰, pH为8.1.

DBP(分析纯, 纯度≥99.5%)购自天津市科密欧化学试剂有限公司, 试验过程中使用丙酮作为助溶剂.

2.2 试验方法 2.2.1 急性毒性试验

试验温度设置为(28±0.5) ℃, 在光照培养箱中进行, 光照周期为12 h:12 h(L:D), 光照强度为2000~3000 lx.试验在100 mL的烧杯中进行, 在烧杯中放入80 mL试验液和10只蒙古裸腹溞幼溞, 根据预实验致死浓度范围的结果, 在5.62~18.11 mg·L^-1中设置5个浓度梯度, 同时设置一个空白对照组(CK)和一个丙酮溶剂对照组(CK-S), 丙酮溶剂的用量按照试验中丙酮浓度最大的梯度进行设置, 每个浓度设3个重复.试验期间不喂食, 记录蒙古裸腹溞在24 h和48 h的死亡率, 死亡标准按照现在国际上通用的标准.将目测枝角类触角不伸展、变形, 将烧杯水旋转10 s溞不游动, 用胶头滴管触碰溞仍没有任何反应作为死亡标准.根据美国国家环境保护署(US EPA) OECD的要求进行试验(OECD, 2004).

2.2.2 慢性毒性试验

根据急性试验结果得到安全浓度相关数据, 进行慢性试验.试验在20 mL的试管中进行, 在烧杯中放入20 mL试验液和1只蒙古裸腹溞幼溞, 根据急性毒性试验的结果, 在0.2~1.00 mg·L^-1中设置5个浓度梯度, 同时设置一个空白对照组(CK)和一个丙酮溶剂对照组(CK-S).每个浓度设置10个重复.试验期间正常喂食蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa), 每48 h更换一次培养液, 保证浓度不变, 暴露直到母溞死亡.每天观察记录溞类死亡数、新生溞类数量、母溞死亡数, 将新生幼溞挑出.新生幼溞在环境条件一致但无药品干扰的培养液中培养.按照OECD推荐的慢性试验方法进行试验(OECD, 2012), 使用上一代的首窝生殖溞作为下一代的试验对象, 以此类推, 除亲代P外, 延续进行4个世代即F1、F2、F3和F4代, 直至5个世代所有溞死亡.整个慢性试验历时25 d, 对照组各世代历时11 d, 试验组各世代历时9 d.

2.3 指标的计算

安全浓度SC(周永欣等, 1989)的计算公式见式(1).平均寿命为世代内存活总时长的平均数；总生殖量为世代内生殖的产幼总数；生殖频率为世代内生殖的产幼次数；每窝生殖量为世代内每次生殖的产幼数量的平均数, 为总生殖量与生殖频率的比值；首窝生殖量为世代内第一次生殖中的产幼数量.内禀增长率(r_m)(Krebs, 1994)计算公式见式(2).

(1)

(2)

式中, r_m为内禀增长率(d^-1); x为日龄(d); l_x为第x天的存活率; m_x为每只母溞每天的产仔数(ind.).

2.4 数据处理

试验所得数据使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析, 并对结果进行多重比较, 显著性水平为0.05.

3 结果(Results) 3.1 DBP的急性毒性试验

试验24 h和48 h内, CK组与CK-S组中蒙古裸腹溞的死亡率无显著差异(p>0.05).根据图 1可知, 试验组中, 随着DBP浓度升高, 溞死亡率逐渐增加.根据试验结果, 采用SPSS20.0软件建立对数浓度与死亡率的回归方程, 计算回归方程的可决系数、半致死浓度和95%置信区间(表 1).DBP对蒙古裸腹溞的24 h LC₅₀、48 h LC₅₀值分别为8.36 mg·L^-1和6.34 mg·L^-1, 95%置信区间分别为7.20~9.36 mg·L^-1和5.08~7.15 mg·L^-1, 安全浓度为1.09 mg·L^-1, R²分别为0.962和0.957.由此可见, 蒙古裸腹溞死亡率与DBP浓度存在紧密的线性关系.

3.2 DBP的慢性毒性试验

DBP对蒙古裸腹溞平均寿命的影响见图 2a.从同世代溞的平均寿命来看, 除F1高剂量组和F2试验组外, 其他所有世代试验组平均寿命均显著低于对照组(p < 0.05).同剂量DBP不同世代溞的平均寿命方面, P代至F4代, 0.6~1.0 mg·L^-1试验组溞的平均寿命随世代增加呈先升后降的趋势, 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg·L^-1浓度下溞平均寿命在F2代达到最高点, 分别为7.6、7.8、6.2、7.8和7.4 d.在DBP的影响下, 0.2 mg·L^-1组溞平均寿命为F2代显著高于P代、F1代和F4代(p < 0.05), 与F3代无显著差异, 0.4~0.6 mg·L^-1组溞平均寿命为F2代显著高于其他世代(p < 0.05), 0.8 mg·L^-1组溞平均寿命为P代、F3代和F4代之间无显著差异, 但P代和F4代显著低于F1和F2代, F1代与F3代无显著差异, F1代和F3代显著低于F2代(p < 0.05), 1.0 mg·L^-1组溞平均寿命为P代、F3代和F4代之间无显著差异, 但均显著低于F1和F2代, F1代显著低于F2代(p < 0.05).

DBP对蒙古裸腹溞总生殖量的影响见图 2b.从同世代溞的总生殖量来看, 除F1高剂量组与对照组无显著差异, F2的0.8 mg·L^-1组与CK-S组无显著差异外, 其他所有世代试验组总生殖量均显著低于对照组(p < 0.05).同剂量DBP不同世代溞的总生殖量方面, P代至F4代, 0.6~1.0 mg·L^-1试验组溞总生殖量随世代增加呈先升后降的趋势, 峰值基本出现在F1代和F2代, 0.4、0.6和1.0 mg·L^-1组溞总生殖量在F3代达到最低点, 分别为2.7、2.2和2.7只.在DBP的影响下, 0.2 mg·L^-1组溞总生殖量各世代间无显著差异, 0.4 mg·L^-1组溞F1~F4代总生殖量均低于P代, 其中, F1代总生殖量显著低于P代, F3代和F4代总生殖量显著低于F2代(p < 0.05).0.6 mg·L^-1组溞P代、F3代和F4代总生殖量为低于F1和F2代, 其中, F3代显著低于P代、F1代和F2代, F4代显著低于F1代和F2代(p < 0.05).0.8 mg·L^-1组溞F1代和F2代总生殖量显著高于P代、F3代和F4代(p < 0.05), 1.0 mg·L^-1组溞F1代和F2代总生殖量为均高于P代、F3代和F4代, 其中, F1代和F2代总生殖量显著高于P代、F3代和F4代, F1代总生殖量显著高于F2代(p < 0.05).

DBP对蒙古裸腹溞生殖频率的影响见图 2c.从同世代溞的生殖频率来看, P代的0.6~0.8 mg·L^-1组生殖频率显著低于对照组, 1.0 mg·L^-1组生殖频率显著低于CK组(p < 0.05)；F1代的0.6 mg·L^-1组生殖频率显著低于对照组, 0.2~0.4 mg·L^-1组生殖频率显著低于CK组(p < 0.05)；F2代的0.6 mg·L^-1组生殖频率显著低于对照组, 0.2、0.4、0.8、1.0 mg·L^-1组生殖频率显著低于CK组(p < 0.05)；F3代的0.6 mg·L^-1组生殖频率显著低于对照组, 1.0 mg·L^-1组生殖频率显著低于CK组(p < 0.05)；F4试验组生殖频率显著低于对照组(p < 0.05), 其他组与对照组无显著差异.同剂量DBP不同世代溞的生殖频率方面, 在DBP的影响下, 0.2、0.4和1.0 mg·L^-1组溞生殖频率各世代间无显著差异, 0.6 mg·L^-1组溞F3代生殖频率显著低于其他各世代(p < 0.05), 0.8 mg·L^-1组溞P代生殖频率显著低于F1~F3代(p < 0.05), 与F4代无显著差异.

DBP对蒙古裸腹溞每窝生殖量的影响见图 2d.从同世代溞的每窝生殖量来看, P代的0.2 mg·L^-1和0.8 mg·L^-1组显著低于对照组, 0.6 mg·L^-1和1.0 mg·L^-1组显著低于CK组(p < 0.05)；F1代的0.2 mg·L^-1和0.4 mg·L^-1组显著低于1 mg·L^-1组(p < 0.05)；F2代的0.4 mg·L^-1组显著低于CK组；F3代所有试验组均显著低于对照组(p < 0.05)；F4代的0.6 mg·L^-1和1.0 mg·L^-1组显著低于对照组(p < 0.05)；F4代的0.2 mg·L^-1和0.4 mg·L^-1组显著低于CK-S组, 其他组与对照组无显著差异.同剂量DBP不同世代溞的每窝生殖量方面, P代至F4代, 试验组溞的每窝生殖量的峰值基本出现在F1、F2代, 在F3代达到最低点.在DBP的影响下, 0.2 mg·L^-1组溞F3代和F4代每窝生殖量显著低于F1代和F2代(p < 0.05), 与P代无显著差异；0.4 mg·L^-1组溞F3代每窝生殖量显著低于P代和F2代(p < 0.05), 与F1代和F4代无显著差异；0.6 mg·L^-1组溞F3代窝生殖量显著低于P代、F1代和F2代(p < 0.05), 与F4代无显著差异；0.8 mg·L^-1组溞F3代每窝生殖量显著低于F1代、F2代和F4代(p < 0.05), 与P代无显著差异；1.0 mg·L^-1组溞F3代和F4代每窝生殖量显著低于F1代和F2代(p < 0.05), 与P代无显著差异.

DBP对蒙古裸腹溞首窝生殖量的影响见图 2e.从同世代溞的首窝生殖量来看, P代的0.2 mg·L^-1、0.6~1.0 mg·L^-1组显著低于对照组, 0.4 mg·L^-1组显著低于CK组(p < 0.05)；F1代和F2代的0.4 mg·L^-1组显著低于对照组, 0.2 mg·L^-1组显著低于CK-S组(p < 0.05)；F3代和F4代试验组首窝量显著低于对照组(p < 0.05).同剂量DBP不同世代溞的首窝生殖量方面, 试验组首窝生殖量在F3代和F4代显著低于对照组(p < 0.05).P代至F4代, 试验组溞的首窝生殖量峰值基本出现在F1代或F2代, 在F3代达到最低点.在DBP的影响下, 0.2 mg·L^-1和0.6 mg·L^-1组溞F3代首窝生殖量显著低于P代、F1代和F2代(p < 0.05), 与F4代无显著差异；0.4 mg·L^-1组溞F3代和F4代首窝生殖量显著低于P代(p < 0.05), 与F1代和F2代无显著差异；0.8 mg·L^-1组溞F3代首窝生殖量显著低于F1代和F2代(p < 0.05), 与P代和F4代无显著差异；1.0 mg·L^-1组溞P代、F3代和F4代首窝生殖量显著低于F1和F2代(p < 0.05).

DBP对蒙古裸腹溞内禀增长率的影响如表 2所示, 从同世代溞的内禀增长率来看, P代试验组、F3代试验组和F4代的0.4 mg·L^-1组显著低于对照组(p < 0.05), 0.4 mg·L^-1组显著低于CK-S组(p < 0.05), 其他所有世代试验组内禀增长率与对照组无显著差异.同剂量DBP不同世代溞的内禀增长率方面, 0.4、0.6、0.8和1.0 mg·L^-1组内禀增长率的峰值出现在F1代, 所有试验组内禀增长率的最低值出现在F3代.在DBP的影响下, 0.2 mg·L^-1组溞P代和F3代内禀增长率显著低于F2代(p < 0.05), 与F1代和F4代无显著差异；0.4 mg·L^-1组溞F3代和F4代内禀增长率显著低于P代和F1代(p < 0.05), 与F2代无显著差异；0.6~0.8 mg·L^-1组溞F3代内禀增长率显著低于P代、F1代、F2代和F4代(p < 0.05)；1.0 mg·L^-1组溞F3代和F4代内禀增长率显著低于P代、F1代和F2代(p < 0.05).由此可见, 浓度0.2~1.0 mg·L^-1的DBP对蒙古裸腹溞的生长发育具有一定抑制作用, 主要表现在对不同世代溞的平均寿命、总生殖量、每窝生殖量和种群增长的影响.

4 讨论(Discussion) 4.1 DBP对蒙古裸腹溞的急性毒性

目前, 环境中的DBP早已受到了广泛监测和控制, 但一些水生生物的污染物检测结果显示其在藻类、浮游动物、鱼类体内仍然存在, 并且不同营养级的生物对于DBP的敏感性也存在显著差异.如淡水绿藻羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum), 当DBP浓度为0.4 mg·L^-1时, 其叶绿素a和藻类细胞数量显著减少(Staples et al., 1997)；5 mg·L^-1的DBP对性成熟之前的萼花臂尾轮虫具有致死作用(Zhao et al., 2009)；斑马鱼(Barchydanio rerio)暴露于DBP中, 其行为活动受到影响, 96 h LC₅₀为8.51 mg·L^-1(李文英等, 2007).因此, 即使不同营养级生物会受到不同程度毒性的影响, 但DBP对生物生长、发育造成的干扰是显而易见的.本实验结果显示, DBP对蒙古裸腹溞的24 h LC₅₀、48 h LC₅₀值分别为8.36 mg·L^-1和6.34 mg·L^-1, 按照毒物分级标准, 属于高毒物质(刘青等, 2013), 即DBP在短时间内对其表现出明显的毒害效应, 与上述结论相吻合.

在实验室条件下, DBP对同为枝角类的大型溞的24 h EC₅₀为10.35 mg·L^-1(黄国兰等, 1998), 对多刺裸腹溞的24 h LC₅₀为8.44 mg·L^-1(刘伟杰等, 2011).结合本实验结果可知, 蒙古裸腹溞和多刺裸腹溞急性毒性相近, 但与大型溞急性毒性存在部分差异, 证明水生生物对毒性的耐受性与淡水、海水环境的影响不大, 但是否存在联系仍需进一步证实.

4.2 DBP对蒙古裸腹溞生殖及种群增长的跨代影响

枝角类作为鱼类食物来源之一, 在水生生态系统能量流动和物质循环方面发挥着重要的作用(Brooks et al., 1965).而目前对于枝角类的大部分生态毒理研究只是关注连续暴露多世代下生物体内的积聚作用引发的慢性毒性效应.本试验旨在研究DBP对连续世代的蒙古裸腹溞生长、繁殖能力的变化及跨代影响(Castro et al., 2018), 为评价DBP对水生生物食物链中不同营养级生物毒性效应提供数据补充.在试验设计方面, 为更好地模拟DBP对不同世代海洋生物的生殖毒性, 采用相对完整的试验周期, 关注连续暴露5个世代下蒙古裸腹溞生殖参数变化.

试验表明, DBP在0.2~1.0 mg·L^-1浓度下对蒙古裸腹溞不同世代会产生不同的毒性影响.比较不同浓度DBP对该溞生长、发育和生殖的影响, 0.2~1.0 mg·L^-1 DBP下大部分世代溞的平均寿命差异不显著, 0.2~1.0 mg·L^-1的DBP对其他生长、生殖指标波动影响无明显规律.比较不同世代溞的生长、发育和生殖受到的影响, 试验组P代的平均寿命、生殖量(总生殖量和首窝生殖量)受到显著影响, 对F1代和F2代影响不显著, 但在F3代, 溞的平均寿命、生殖量(总生殖量、每窝生殖量和首窝生殖量)及种群增长受到显著抑制, 试验组F4代的平均寿命、生殖量(总生殖量和首窝生殖量)也受到了显著影响.亲代蒙古裸腹溞的变化证明了DBP的毒害作用, 而在距离较远的世代, 溞对环境的耐受性变差, 溞的敏感性增强, 在F3代出现了明显的跨代影响.跨代影响的出现可以解释为生物在环境激素的干扰下产生了遗传变异(Vandegehuchte et al., 2010; Baker et al., 2014), 低浓度污染物诱导产生的有害影响可能没有即时出现, 而是传递给后续世代, 由于毒性的积累或生物耐受性的降低, 距离较远世代的生物表现出生长、发育、繁殖能力的减弱.这种毒性效应的传递主要体现在平均寿命和生长生殖方面, 与生殖频率无关.产生这种差异的原因可能与枝角类的生物特性有关, 大型溞在0.3~0.6 mg·L^-1的DEHP影响下, 在F3代同样出现了跨代影响, 但其生殖频率同样没有受到显著影响(魏杰等, 2019).值得注意的是, 内禀增长率是反映物种种群增长程度最重要的指标, 与其他指标相比, 对生物生殖发育变化更加敏感, 而这项指标首先在试验组F3代和F4代种群增长变化上得到了体现, 在0.6~0.8 mg·L^-1试验组中, F3代溞的种群增长显著低于F4代, F4代溞的生殖得到了一定的恢复, 这种情况的出现可能是生物的补偿机制.这点也与Bacchetta等(2017)、刘伟杰等(2011)在大型溞和多刺裸腹溞上的研究相符.DBP毒性表现出的跨代影响是否具有持续性有待进一步研究.

枝角类作为水体中浮游动物的主要组分, 是水生生态系统中发挥生态作用的重要一环.但目前应用跨代影响对不同环境污染物进行评价主要以淡水枝角类大型溞为主(Vandegehuchte et al., 2010), 不适合于海水污染监测工作.而蒙古裸腹溞作为已在海水中驯化成功的枝角类, 同时也是潜在的模式生物的一种, 已在海水养殖生产中发挥了很大作用.本研究表明, DBP对蒙古裸腹溞的毒性效应可以传递给后续世代, 本研究的一些结果可以为PAEs对枝角类跨代效应相关研究提供数据参考.

5 结论(Conclusions)

研究表明, 在急性试验中DBP对蒙古裸腹溞的24 h LC₅₀为8.36 mg·L^-1, 48 h LC₅₀为6.32 mg·L^-1, 安全浓度为1.09 mg·L^-1, 存在着随DBP浓度升高溞死亡率上升的规律.而在5个世代的慢性毒性试验中, 在0.2~1.0 mg·L^-1 DBP的影响下, 与对照组相比, F3代和F4代溞的平均寿命、总生殖量和每窝生殖量显著降低, 其生长生殖被抑制, 出现了明显的跨代效应.