2021, Vol. 41
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2. 陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司, 西安 710075;
3. 自然资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室, 陕西省土地工程建设集团有限责任公司, 西安 710075;
4. 中国科学院生态环境研究中心, 水污染控制实验室, 北京 100085;
5. 中国科学院大学, 北京 100049;
6. 北京市北运河管理委员会昌平区管理段, 北京 102209;
7. 北京市昌平区沙河闸管理处, 北京 102206
2. Institute of Land Engineering and Technology, Shaanxi Provincial Land Engineering Construction Group Co., Ltd., Xi'an 710075;
3. Key Laboratory of Degraded and Unused Land Consolidation Engineering, the Ministry of Natural Resources, Shaanxi Provincial Land Engineering Construction Group Co., Ltd, Xi'an 710075;
4. Laboratory of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
5. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049;
6. Changping District Management Section of Beijing North Canal Management Committee, Beijing 102209;
7. Shahezha Management Office, Changping District, Beijing 102206
由于分散污水、合流制溢流污水和再生水等非常规水源对城市河流的补给, 导致城市河流水体中的病原微生物污染对人类健康构成了潜在威胁.据报道(杨勇等, 2012；陈亚楠等, 2015), 我国七大水系均已受到不同程度的病原微生物污染.在地表水体中, 大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)、粪大肠菌群(Fecal coliform, FC)、肠球菌(Enterococcus, ENT)、总大肠菌群(Total Coliforms, TC)是现行的国内外地表水环境标准中所采用的指示菌(Fecal indicator bacteria), 而沙门氏菌(Salmonella)和志贺氏菌(Shigella)则是使人体致病的病原菌(Pathogenic bacteria).尽管我国现行的地表水环境质量标准(GB3838—2002)仅以粪大肠菌群作为地表水微生物污染的评价指标, 但致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌)是水体微生物风险性的主要来源(张振兴等, 2016).
病原微生物广泛分布于地表水体及其沉积物中, 沉积物可为病原微生物提供多方面的保护作用(减弱紫外线照射、形成厌氧环境、提供营养物质等)(Brandl, 2006).同时, 沉积物中病原微生物的浓度远高于上覆水体, 且沉积物的再悬浮或水流冲刷会造成病原菌的释放和吸附(崔祁嘉, 2017), 导致病原微生物在地表水体中能够长期存活与生长, 使地表水体具有长期的微生物污染风险.已有研究表明, 地表水体沉积物中广泛富集了大肠杆菌、粪大肠菌群、肠球菌等指示菌, 以及沙门氏菌和志贺氏菌等致病菌(Satoshi et al., 2007；Fries et al., 2008；Pachepsky et al., 2011；Perkins et al., 2014).
北运河属于海河流域北系, 是以非常规水源补给的城市河流, 多数河段水质为劣V类(李延等, 2014), 其非常规水源补给大部分来自于城镇污水处理厂退水、分散点源输入和合流制溢流.据杨勇等于2010年的调查研究, 北运河的温榆河段微生物污染严重, 与地表水V类水质标准(GB 3838—2002)相比, 粪大肠菌群浓度平均超出2个数量级(杨勇等, 2012).相关研究表明, 整个海河流域(上游—永定河、中游—北运河、下游—滨海段)受到了较为严重的微生物污染, 其中, 北运河中游段微生物污染水平最高(Wang et al., 2015；王江权等, 2017).北运河以非常规水源补给为主, 微生物污染严重, 但有关河流沉积物中的病原微生物污染情况目前仍未见报道.因此, 本研究选择北运河上游段沙河水库为研究区域, 通过分子生物学手段分析沙河水库沉积物中微生物群落结构并对典型指示菌和致病菌的基因丰度定量, 研究沙河水库沉积物中微生物群落结构和病原微生物污染特征, 以期为北运河病原微生物污染风险评价提供依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区域概况沙河水库位于北运河源头, 是北运河重要节点(图 1), 流域面积约为1125 km2 (张伟等, 2012).北运河是北京市重要排水河道, 1999—2005年污水年均入库量约占来水总量的55% (郁达伟等, 2012).3条主要支流东沙河、北沙河、南沙河汇入沙河水库(刘博等, 2011).沙河水库是由沙河闸控制的河道式水库, 建于1960年, 水库总面积约为1.8 km2, 总库容2045万m3, 历史日均出库流量约12.5万m3·d-1, 水力停留时间达69~110 d(孙文等, 2019).
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| 图 1 沙河水库沉积物采样点布置与分区图 Fig. 1 Arrangement and zoning map of sediment sampling points in Shahe Reservoir |
以沙河水库为研究区域设置沉积物采样点11个(图 1).2018年3月采用彼得森采泥器采集0~20 cm表层沉积物, 并用自重力柱状采泥器(r=50 mm, h=60 cm)在采样点P2、P5、P6、P8、P10、P11采集6根沉积物柱状样.沉积柱按顶部2 cm分1层(L1层), 底部2 cm分1层(L5层), 中间部分均等分3层(L2~L4层), 每根沉积柱共取5个样本.分层样品与沉积物表层样品冷冻干燥(FD-1A-50型冷冻干燥机, 北京博医康实验仪器有限公司)后, 用玻璃棒压散, 剔除砾石、贝壳及动植物残体等杂质, 用研钵研磨后过100目筛备用.
2.3 分析方法 2.3.1 DNA提取沉积物样品冷冻干燥后称取0.1 g于2 mL裂解管中, 使用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP bio, USA), 按照试剂盒说明步骤提取DNA.
2.3.2 微生物群落结构分析基于高通量测序测定16S rRNA V4区PCR产物基因序列, 对各样品中微生物群落结构进行分析.使用的PCR引物为515F/806R, 在正向引物前加上barcode序列以区分不同样品的PCR产物, 每个样品重复3次PCR, 进行混匀, 然后PCR产物进行胶回收后, 来自不同样品的PCR产物等量混匀, 建库、测序；建库测序交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成, 测序平台为Illumina MiseqTM.对于Miseq双端测序数据, 首先需要去除引物接头序列(TGGAATTCTCGGGTGC CAAGGAACTC), 再根据PE reads之间的overlap关系, 将成对的reads拼接(merge)成一条序列, 然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据, 最后对各样本数据的质量进行质控过滤, 得到各样本有效数据(陈浮等, 2017).
2.3.4 定量PCR(qPCR)分析基于美国环保署(USEPA)、欧盟(EU)、世界卫生组织(WHO)等有关地表水体的病原菌标准, 本研究选取典型病原菌大肠杆菌、肠球菌作为指示菌, 志贺氏菌为致病菌进行去qPCR定量分析, 取基因拷贝数(DNA copies·g-1)表示其在沉积物中对应的含量, 相对丰度以16S rRNA进行标准化.
本研究定量PCR主要采用的试剂为SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)(TAKARA)与RNase-free Water(Ambion), 并在微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)与荧光定量PCR仪(StepOne Plus)上进行.肠球菌、肠杆菌、志贺氏菌的目的基因片段的扩增效率分别为99.54%、97.82%、105.45%, 引物序列及机制见表 1.
| 表 1 本研究中所用引物序列及机制 Table 1 Primers used in this study and their mechanisms |
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针对微生物群落分析, 沙河水库表层沉积物中细菌群落在菌落水平的分布特征在不同区域有所差异(图 2a), Clostridium sensu stricto、unclassified_Anaerolineaceae、Povalibacter 3种菌属在表层沉积物中的相对丰度较高, 其均值分别达到7.84%±2.51%、7.10%±1.81%、2.16%±0.87%.此外, 基于VFDB细菌毒力因子数据库分析(Chen et al., 2011), Clostridium sensu stricto属于病原菌, 其芽孢杆菌属容易诱发炭疽和脑炎, 其梭菌属为革兰氏阳性厌氧菌, 广泛分布于土壤、污泥、人和动物的肠道中.Clostridium sensu stricto与unclassified_Anaerolineaceae的水平分布规律基本相同, 在库下游(P1、P2、P3, 9.00%、5.72%)、库心区(P4、P5, 9.06%、6.01%)、库上游(P6、P7, 7.42%、5.69%)、北沙河河道(P8、P9, 6.72%、9.18%)、南沙河河道(P11, 9.23%、10.57%)、点源污染区(P10, 3.65%、8.66%)的相对丰度均占绝对优势, 而Povalibacter则在库下游(2.93%)、北沙河河道(2.87%)、库上游(2.18%)的相对丰度占比较高.点源污染区(P10)与其他采样点菌落分布差异较大, 除unclassified_Anaerolineaceae相对丰度较高外, Thiohalobacter(5.20%)与Clostridium XI(4.47%)同样占主导地位, 这可能与点源污染区的COD和氨氮浓度较高有关(Rui et al., 2011).沙河水库库区沉积物与河道沉积物的群落结构略有不同, 主要差异表现在Thiohalobacter在河道沉积物群落结构中的占比远高于库区沉积物, 其原因可能是Thiohalobacter为化能自养硫氧化专性好氧菌, 可氧化硫化物、单质硫并可还原硝酸盐(王佳乐, 2018), 河道较快的水流速度与上游排放的生活、生产废水为其生长、繁殖提供了良好的生存环境.
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| 图 2 沙河水库沉积物样品中前10属水平分布热图 (基于log2转化的reads数) Fig. 2 The heatmap of top 10 genus in each sample based on the reads (log2 transformed) |
如图 2b所示, 将不同细菌菌落与各采样点进行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)发现, 北沙河河道、沙河水库库区(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7)与点源污染区、南沙河河道差异性显著.不同区域的微生物表现出了一定的差异性, 这可能是由水力条件扰动、沉水植物种类、底栖动物种类不同等因素导致.但整体上, 库心区的微生物群落结构非常接近, 而点源污染区和河道均具有不同的微生物群落结构特征.在这些微生物中, 沙河水库表层沉积物中存在较多类型的病原菌, 如芽孢杆菌(Bacillus)在北沙河河道(1.61%)与库下游(0.95%)相对丰度较高, 而梭状芽孢杆菌(Clostridium XI)则在点源污染区(4.47%)、库上游(1.46%)表现出较高的相对丰度.
3.1.2 垂直分布垂直分布上(图 3), 沙河水库沉积柱不同深度样本中的微生物群落结构有一定的共性, 具体表现在不同沉积柱不同深度样本中相对丰度最高的菌属均为厌氧绳菌科(Anaerolineaceae), 平均丰度达到6.36%±2.17%, Anaerolineaceae作为绿弯菌门的代表菌科, 其不仅具有反硝化的功能(张晓红等, 2019), 同时还有降解碳水化合物和其他有机物(如氨基酸)的作用(李玲丽, 2015).沉积物中的厌氧环境可能为Anaerolineaceae提供良好的生存条件, 从而作为优势菌属在群落结构中占主导地位.不同沉积柱2 cm以下深度样品中则以硫氧化菌属(Sulfuricurvum)相对丰度最高, 均值达7.81%.Sulfuricurvum作为底泥沉积物中广泛存在的功能菌属(Kodama et al., 2011), 能以氧气或硝酸盐作为电子受体氧化硫化物, 从而导致底泥发黑发臭(王霖等, 2015).将不同沉积柱不同深度样本与各菌落相对丰度进行PCA分析(图 3b), 发现不同深度样本L1层与L2~L5层存在极显著的差异性, 而深度接近的样本层则差异较小.与表层沉积物中的潜在病原菌相比, 经过VFDB毒力因子数据库判定, 沙河水库垂向沉积物中还存在可以导致人类中耳炎、脑膜炎等疾病的绿脓杆菌(Pseudomonas), 其在库下游(P2)L2层(2~18 cm)、库心区(P5)L1层(0~2 cm)、南沙河河道(P11)L3层(10~20 cm)的相对丰度较高(4.32%、1.69%、1.67%).绿脓杆菌作为一种好氧反硝化细菌, 库下游(P2)、库心区(P5)、南沙河河道(P11)沉积物中高的营养盐含量(孙文等, 2019)为其提供了良好的生存环境.
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| 图 3 沙河水库沉积物样品中前10属垂向分布热图 (基于log2转化的reads数) Fig. 3 The heatmap of top 10 genus in each sample based on the reads (log2 transformed) |
不同区域大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的基因分布存在明显差异(图 4), 以单个病原微生物的基因丰度难以有效指示其他病原微生物的基因丰度分布.指示菌大肠杆菌、肠球菌与致病菌志贺氏菌在沙河水库表层沉积物中丰度占优势的区域分别为库下游(P3)、库区(P5、P6)与点源污染区(P10).肠球菌的绝对丰度与相对丰度在库下游(P1、P2、P3)、库心区(P6、P7)、库上游(P6、P7)、河道(P8、P9、P11)与点源污染区(P10)均高出大肠杆菌1~2个数量级、志贺氏菌2~3个数量级.
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| 图 4 沙河水库沉积物中大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌水平分布 Fig. 4 Horizontal distribution of Escherichia coli, Enterococcus and Shigella in sediments of Shahe Reservoir |
大肠杆菌和肠球菌是现行的国内外地表水环境标准中所采用的指示菌, 将大肠杆菌作为指示菌时沙河水库沉积物污染较严重的区域为库下游(P3, 绝对丰度为1.56×108 copies·g-1, 相对丰度为1.70%)与点源污染区(P10, 绝对丰度为6.76×107 copies·g-1, 相对丰度为0.20%), 约比其他区域样本的丰度高出1个数量级.而将肠球菌作为地表水体微生物污染严重程度的指示菌时, 沙河水库污染严重的区域则是库区(P6, 绝对丰度3.74×109 copies·g-1, 相对丰度为28.30%；P5, 绝对丰度3.63×109 copies·g-1, 相对丰度为23.0%)、库下游(P3, 绝对丰度3.09×109 copies·g-1, 相对丰度为23.40%)、点源污染区(P10, 绝对丰度2.46×109 copies·g-1, 相对丰度为7.60%)与库下游(P1, 绝对丰度1.25×109 copies·g-1, 相对丰度为20.50%).致病菌志贺氏菌在点源污染区(P10, 绝对丰度为1.32×107 copies·g-1, 相对丰度为0.04%)丰度最高, 库下游(P2, 绝对丰度为8.54×106 copies·g-1, 相对丰度为0.07%)、库区(P4, 绝对丰度为4.80×106 copies·g-1, 相对丰度为0.07%)次之.
3.2.2 垂直分布特征沙河水库沉积物中大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的垂直分布表现出一定的共性(图 5), 说明单一病原微生物在垂直方向上能够指示其他类病原微生物的分布情况.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的相对丰度在南沙河入库口(P11, 1.70%、3.70%、4.12%)与北沙河入库口(P8, 0.36%、9.22%、2.51%)作为代表点呈现出在10~30 cm处明显升高的现象.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌在库心区(P5, 1.23×107、3.11×108、1.08×107 copies·g-1)、点源污染区(P10, 1.56×107、7.98×108、3.34×106 copies·g-1)作为典型区域, 在0~10 cm处的绝对丰度最高.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌在靠近水面的沉积物区域表现出的较高绝对丰度, 可能是由泥水界面所含有的较高有机质含量为其提供良好的营养源所致.与之相反, 大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌在0~10 cm处的相对丰度却远小于10~30 cm处(以P8、P11为例), 这是由于P8、P11位于南北沙河入库口, 此处较高的水流速度与频繁的水位波动使沉积物表层处于缺氧-好氧交替的环境条件, 为好氧或兼性厌氧菌提供了良好的生境(王元涛等, 2020), 微生物量总体较高.因此, 0~10 cm的沉积物中大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的基因占16S rRNA的比例较低.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌均为兼性厌氧细菌, 沉积物10~30 cm处的水力扰动因素较小, 为其生长提供了良好的厌氧环境, 因此, 3种病原菌在10~30 cm处的丰度高于表层.
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| 图 5 沙河水库沉积物中大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌垂直分布 Fig. 5 Vertical distribution of Escherichia coli、Enterococcus and Shigella in sediments of Shahe Reservoir |
根据孙文等(2019)对沙河水库相应采样点沉积物中营养盐和有机质含量在水平和垂直分布上的研究结果, 对表层沉积物中大肠杆菌、肠球菌、志贺氏菌基因的绝对丰度与总氮、总磷、有机质含量进行Pearson相关分析, 结果表明(图 6和表 2), 大肠杆菌基因绝对丰度与总氮(r=0.758, P < 0.05), 志贺氏菌基因绝对丰度与有机质(r=0.789, P < 0.01)均呈显著性正相关.因此, 水平分布上, 病原微生物基因丰度与沉积物污染程度有一定的关联性, 但不同类型的病原微生物间分布存在着差异.
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| 图 6 沉积物中病原菌与TN、有机质水平分布的皮尔逊相关性分析 Fig. 6 The Pearson correlation analysis between pathogenic bacteria and TN、OM in the sediment |
| 表 2 沉积物中病原菌与TN、TP、有机质水平分布的皮尔逊相关性分析 Table 2 The Pearson correlation analysis between pathogenic bacteria and TN、TP、OM in the sediments |
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沙河水库沉积物中大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的绝对丰度与总氮、总磷、有机质垂直分布的Pearson相关性分析(图 7、表 3)表明, 大肠杆菌的绝对丰度与TN(r=0.580, p < 0.05)、有机质(r=0.534, p < 0.05)呈显著正相关, 而志贺氏菌的绝对丰度与总磷(r=0.517, p < 0.05)也呈显著正相关.值得注意的是, 沙河水库沉积物的总氮在垂直分布与水平分布上均与大肠杆菌呈显著正相关.其原因可能是不同环境条件(pH偏酸或偏碱、水温增高、溶解氧增大、水动力条件较强等)的改变均会释放氮、磷等营养盐(卢俊平等, 2015), 进而造成TN在沉积物表层含量较高、深层含量较少.有研究表明, 温度是影响细菌的丰度、群落结构和活性的原因之一, 较高的温度有利于提高微生物的活性和基质的有效性(王元涛等, 2020), 这同时也导致表层沉积物中大肠杆菌的绝对丰度略高于底层沉积物.
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| 图 7 沉积物中病原菌与TN、TP、有机质垂直分布的皮尔逊相关性分析 Fig. 7 The Pearson correlation analysis between pathogenic bacteria and TN、TP、OM in the sediment |
| 表 3 沉积物中病原菌与TN、TP、有机质垂直分布的皮尔逊相关性分析 Table 3 The Pearson correlation analysis between pathogenic bacteria and TN、TP、OM in the sediments |
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1) 沙河水库沉积物的微生物群落结构在水平分布上每个区域差异不大, 均以Clostridium sensu strictoxi相对丰度占比最大(7.84%±2.51%), unclassified_Anaerolineaceae(7.11%±1.81%)、Povalibacter(2.16%±0.87%)次之；垂向沉积物中的微生物群落结构在不同深度样本间有所差异, Anaerolineaceae在各沉积柱样本的L1~L5层(除P5点L1层)的相对丰度均占比最高, 均值达6.36%±2.17%, Sulfuricurvum(7.81%±7.82%)则在各沉积柱的L2~L5层占优势.沙河水库表层沉积物中存在的病原菌, 如芽孢杆菌(Bacillus)在北沙河河道(1.61%)与库下游(0.95%)相对丰度较高；梭状芽孢杆菌(Clostridium XI)则在点源污染区(4.47%)、库上游(1.46%)表现出较高的相对丰度.垂向沉积物中的病原菌Pseudomonas在库下游(P2点L2层, 4.32%)、库心区(P5点L1层, 1.69%)、南沙河河道(P1点L3层, 1.67%)的相对丰度较高.
2) 大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌在沙河水库表层沉积物中的水平分布存在差异.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的绝对丰度在水平分布上分别在库下游、库心区、点源污染区最高, 而相对丰度分别在库下游、库上游、库心区最高.大肠杆菌、肠球菌与志贺氏菌的绝对丰度在沉积物中的垂直分布均呈现随深度的增加而减小的趋势, 相对丰度均在10~30 cm处出现峰值.将大肠杆菌作为指示菌时沙河水库病原微生物污染严重区域为库下游与点源污染区, 而将肠球菌作为指示菌时污染严重的区域则是库区.
3) 水平分布上, 沙河水库沉积物中大肠杆菌与总氮(p < 0.01)、志贺氏菌与有机质(p < 0.05)呈现Pearson显著正相关；垂直分布上, 大肠杆菌与总氮(p < 0.05)、有机质(p < 0.05), 志贺氏菌与总磷(p < 0.05)均呈显著正相关关系, 说明沙河水库沉积物中的病原菌分布和污染程度与沉积物中的氮、磷和有机质负荷有显著关联.
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