1 引言(Introduction)

自湿地技术问世以来, 国内外兴建了众多人工湿地.人工湿地技术实质上为自然湿地去污功能的人为系统强化(Wu et al., 2016), 是一种较为前沿和环保的微污染水处理方法.人工湿地处理污水具有价格低廉、运行管理方便、处理效果好等优点(Vymazal, 2005；Zhou et al., 2017), 可以处理生活污水、工业废水、富营养化水体、油田外排水等(蒋倩文等, 2019；杜显元等, 2020), 现阶段应用最广泛的为建造在污水处理厂附近以进一步提高尾水水质(Solano et al., 2004；王楠等, 2017).人工湿地一般分为表面流人工湿地、水平潜流人工湿地和垂直潜流人工湿地.其中, 表面流人工湿地通常占地面积较大且易滋生蚊虫, 但运行成本较低；潜流人工湿地占地面积小且具有优良的去除效果, 然而运行及维护成本较高, 在实际工程中往往需要根据不同的需求合理选择最优的人工湿地建设方案.

垂直潜流人工湿地作为一种生态工程水处理技术, 适用于广大农村及中小城镇的污水处理, 符合我国国情, 具有广阔的应用前景.其基质种类、粒径的选择及组配方式都会影响湿地对污染物的去除效果, 据前人研究表明, 含铁丰富或者含钙丰富的基质可有效提高人工湿地对磷素污染物的净化效果, 而选择含铝丰富的基质可有效提高对氨氮污染物的吸附效果(叶建锋, 2007).在寒冷地区, 低温条件会在一定程度上影响湿地对各种污染物的去除效果(廖雪珂等, 2020), 有研究证明在低于15 ℃的环境下, 温度会明显抑制含氮污染物的去除(Werker et al., 2003).植物的生长会受到低温条件的影响, 进一步影响到其对污染物的吸收作用, 同时过低的温度环境会影响微生物对污染物的代谢(殷峻等, 2007).然而, 对于垂直潜流人工湿地而言, 系统纵深比较大, 具有很好的保温效果, 其在寒冷地区运行受低温影响较小(陈洋, 2015).

目前普遍认为人工湿地净化效果是基质-微生物-植物三者间物理、化学、生物共同作用、相互影响的结果(成水平等, 2002).但关于人工湿地系统内部水质净化过程与生物地化要素之间的关联及响应机制的认识还较为匮乏, 近年来虽然逐渐形成了湿地建设统一规范和标准, 但在该方面的研究还存在着较大的空白(成水平等, 2019).微生物是影响人工湿地水质净化效果的重要因素, 一方面能够促进污染物的转化降解, 另一方面又因生物膜脱落堵塞介质而影响过水效率(周博等, 2015；王天志等, 2019).目前针对湿地微生物的研究大多关注其群落分布或土壤理化因子对其群落的影响(韩畅等, 2020；湛佳伟等, 2020；张爱娣等, 2020；季淮等, 2021), 尚未建立其与各水质指标净化效果的内在联系.

基于此, 本研究依托宜昌市猇亭区生态湿地扩容改造试验项目, 采用垂直潜流人工湿地处理冬季某污水处理厂达一级A标准的尾水, 分析低温条件下垂直潜流人工湿地的水质净化效果, 探究湿地微生物群落结构的时空变化特征, 建立各基本水质指标与微生物群落间的联系, 以期为后续有关人工湿地水质净化过程的微生物作用机理研究提供一定的参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 湿地结构及运行设计

本试验自主设计的垂直潜流人工湿地, 池体由经过防腐处理的钢碳材料浇筑而成, 其长×宽×高=2.5 m×2 m×1.5 m, 设计水深1.25 m(图 1).湿地布水系统采用“丰”字形, 池体填料为砾石、桃核烧制的生物炭、石灰石、沸石、铁基质, 体积百分比分别为28%、38.4%、16%、16%、1.6%, 此外, 在池底还铺设高度为50 mm的大砾石, 具体填料铺设见表 1.池体表层搭配种植风车草、菖蒲、水葱, 种植密度为9株·m^-2.湿地试验水源为宜昌市猇亭污水处理厂现有一期工程尾水, 在运行期间进水COD为17~54 mg·L^-1, TN为3.8~10.45 mg·L^-1, TP为0.08~0.47 mg·L^-1.

2.2 水质检测及微生物取样

本试验持续监测时间约1个月, 每天在固定时间采样2次, 每次采集2组平行样, 具体监测过程如下：在进水和出水位置, 使用哈希HQ40d原位测定DO、pH指标, 并分别采集250 mL水体, 于4 ℃保存至实验室, 其他水质指标2 h之内在实验室完成检测分析.为了解其微生物情况, 分别于2019年11月25日、12月3日、12月20日和2020年1月9日进行4次微生物采样过程, 根据池体填料铺设设置5个取样口(图 1), 取样口的设置尽量避开植物根围, 其中, A1取样口可取出覆盖层砾石, A2取样口取出生物炭, A3取样口取出沸石和石灰石, A4取样口取出底层生物炭和铁基质, A5取样口取出排水层砾石, 每次采样共计取出7种基质样品, 用棉签蘸取各基质样品表面微生物, 放入2 mL离心管中并分别标号, -20 ℃保存.

各样点水体的总氮(TN)、总磷(TP)和化学需氧量(COD), 根据GB11893-89, 分别以硫酸钾氧化紫外分光光度法、重铬酸钾法、钼酸铵分光光度法, 由分光光度计(哈希, DR300)测定.记录所得原始数据并储存在Excel表格中, 以两组平行样的均值作为每次采样的结果, 每日两次采样的均值作为当天的结果.

2.3 微生物分析方法 2.3.1 基因组DNA的提取和PCR扩增

使用FastDNA SPIN试剂盒对棉签蘸取的基质样品表面微生物DNA进行提取, 稀释于60 μL TE缓冲液(10 mmol·L^-1 Tris HCl, 1 mmol·L^-1 EDTA, pH=8.0)中.使用Thermo Fisher NanoDrop-2000测定提取DNA的浓度和纯度后, 存储于-20 ℃条件下直至使用.纯化好的DNA使用16S V4区通用引物对515F：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTA CNVGGGTWTCTAAT-3′进行扩增, 扩增程序为：98 ℃预变性1 min, 接着进行30个循环, 包括98 ℃变性10 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s；循环结束后72 ℃延伸5 min.

PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样, 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 对目的条带使用Gel Extraction Kit试剂盒回收.

2.3.2 高通量测序与数据处理

目的产物使用TruSeq^Ⓡ DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 提纯后的DNA使用NovaSeq6000进行上机测序.

所有样本的全部Effective Tags使用Uparse软件(Uparse v 7.0.1001)进行聚类, 以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units), 同时选取OTUs的代表性序列, 依据算法原则筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列, 并以样本中序列最少的序列数为标准对所有样本进行均一化处理.

基于OTUs水平进行物种聚类分析, 选择属水平丰度前35物种注释得到物种丰度聚类热图, 对应的值为每一行物种相对丰度经过标准化处理后得到的Z值, 即一个样本在某个分类上的Z值为样本在该分类上的相对丰度与所有样本在该分类的平均相对丰度的差除以所有样本在该分类上的标准差所得到的值.运用NMDS(Non-metric multidimensional scaling, 非度量多维尺度分析, Bray-Curtis距离)分析, 通过点与点间的距离体现不同样本间的差异程度, 展现各样点微生物群落分布特征, 并采用ANOSIM检验方法进行组间差异的显著性分析, 由R软件(Version 2.15.3)的vegan软件包实现.运用PCA(Principal component analysis, 主成分分析)对湿地各理化指标(TN、氨氮、TP、COD、DO)与微生物群落结构变化的相关性进行分析, 识别影响微生物群落的环境因子, 由Origin2020b(学习版)绘制完成.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 湿地水质净化效果 3.1.1 进出水水质对比分析

根据试验总体工期, 以试验开始前10 d为初期, 11~20 d为中期, 21 d及以后为后期.在湿地运行稳定期间, 经过对进出水的逐日监测, 发现经人工湿地处理后, 各水质指标浓度呈现不同程度的下降(图 2).进水水质的变化对湿地中各水质指标的去除效果产生不同程度的影响, 进出水水质变化趋势整体上呈现一致性, 但出水水质变化过程存在着一定的滞后性.进出水DO在湿地运行前期变化大, 从12月3日开始出水DO能维持在9 mg·L^-1的水平.pH在湿地运行期间均保持在8左右, 随着湿地运行时间的延长, 进出水pH差值也逐渐缩小并趋于一致.对比TN、TP、COD和氨氮的去除效果, 发现COD总体去除效果最好, 但TN去除程度受进水水质波动的影响最大, 当进水TN由7.2 mg·L^-1降至6.6 mg·L^-1, 出水总氮分别达到2.75、3.85 mg·L^-1, 此时去除率由61.81%降低至41.67%.对于同一水质(如TN), 由于出水水质变化滞后于进水水质, 导致出水水质去除程度在进水水质相对于前一天升高的时候较大(如11月21日), 相反则较低(如11月25日).

3.1.2 氮的去除效果分析

试验中出水TN平均值为4.82 mg·L^-1 (图 3a), 未达到准IV类水排放标准, 平均去除率为38.5%, 最高可达63.6%, 这说明基质具有较好的脱氮效果.然而, 与国内某些人工湿地TN去除率能维持在80%左右的情况相比(田锁霞等, 2016；周新伟等, 2017；毕昇等, 2019；蒋倩文等, 2019), 本研究湿地的脱氮效果并没有达到最佳状态.首先, 由于湿地试验进水为污水处理厂尾水, 可生化性差、碳氮比过低(< 6), 一般污水中碳氮比低于6时视为碳源不足, 这在一定程度上制约了反硝化过程.其次, 本试验选择在冬季低温条件下运行, 期间平均温度为12.16 ℃(图 2d).研究认为, 在气温低于15 ℃时, 含氮污染物的去除会受到抑制, 且一般反硝化最佳温度环境为20~40 ℃(杜显元等, 2020).此外, 冬季植物凋落矿化过程会向介质中释放无机氮, 从而增加一定的硝态氮含量.因此, 可通过向进水水质投放碳源、提高进水水温和清除植物残渣等方法, 提高冬季湿地的脱氮效果.

3.1.3 磷的去除效果分析

本试验TP出水浓度为0.04~0.36 mg·L^-1, 不符合准IV类水出水标准, 平均值为0.26 mg·L^-1, 去除率为7.9%~53.2%, 平均去除率为26.8%, 低于目前人工湿地TP可达60%以上的去除率(赵林丽等, 2019；巴图那生等, 2019), 且总体相对于TN去除效果较差一些(图 3b).目前普遍认为, 人工湿地对磷的去除主要有3种途径：植物的吸收和积累、微生物的同化和聚磷菌的过量摄磷、基质的物理化学作用.其中, 基质的吸附作用和络合沉淀作用是人工湿地最主要的除磷方式, 贡献率高达70%~87%, 湿地基质中钙和有机物的含量对磷的吸附能力有直接影响.微生物对人工湿地总磷的去除贡献并不大(梅思俐, 2020), 研究表明, 人工湿地中约14%的磷通过微生物作用得以去除, 而且这部分被微生物吸收利用的磷处于不断吸收和释放的动态过程中, 当微生物死亡后会被迅速释放回水体中.因此, 针对磷污染较为严重的污水, 可通过设计针对性基质和高频率收割植物方法, 提高磷去除效率.

3.1.4 COD去除效果分析

湿地运行期间, 进水COD在11月18、19、24日及12月5、18日出现超标, 分别达到78.0、68.5、55.0、52.0、54.0 mg·L^-1, 但出水COD普遍低于30 mg·L^-1, 符合出水的准IV类水要求.COD去除率为23.9%~71.4%, 平均去除率为42.0%, 去除效果总体平稳(图 3c).COD可表示水中有机污染物的浓度, 在人工湿地系统中存在多种复杂的有机物去除途径, 按去除原理分为有机物的非降解去除和降解去除, 包括植物、微生物和基质的共同作用, 其中, 微生物是人工湿地去除有机物的主导者.温度是影响微生物去污作用的重要因素, 不仅影响湿地系统中微生物的代谢速率, 还影响着微生物种群和群落的动力学乃至群落的结构和功能, 从而影响有机物的降解效率.本试验针对的是湿地冬季运行情况, 且进水为污水处理厂低碳氮比尾水, 其可生化性差, 加大了COD去除难度.一般情况下, 湿地对COD的去除率可达80%~90%, 研究人员在不同条件下人工湿地去除二级生化尾水效能中发现人工湿地在夏秋两季对污水COD的去除率最高可达到63%左右, 而在冬季低至44%, 得出湿地对COD的去除效果与环境温度密切相关的结论(肖椿等, 2019).本试验中COD去除率与上述研究冬季所得结果基本吻合, 低温条件下原本对COD去除起作用的菌群无法发挥作用, 只剩下一部分耐低温的微生物处理污水污染物, COD去除效果因而减弱.其次, 低温造成大量水生植物凋亡, 植物根系输氧能力下降, 造成环境中溶解氧浓度变化, 对COD去除效果也产生了影响.

3.2 湿地基质表面微生物的时空变化 3.2.1 微生物组成分布

根据物种丰度聚类热图(图 4), 整体上可以看出拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门为该湿地中优势菌门.近年来, 研究人员利用OTUs聚类分析发现了许多与脱氮相关的菌群(陈宏等, 2020), 与在实验室中利用培养计数法研究微生物丰度的传统方法(周元清等, 2011)相比, 现阶段常用的高通量测序技术更为方便快捷, 所得结果也更准确可靠.研究表明, 属于氨氧化古菌的奇古菌门(Thaumarchaeota)(Céline et al., 2008)、厌氧氨氧化菌中的浮霉菌门(Planctomycetes)(Wang et al., 2012)及与全程硝化相关的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)(Damis et al., 2015；Van et al., 2015), 均是影响到湿地氮处理效果的微生物, 变形菌门和厚壁菌门中含有丰富的反硝化菌属, 硝化螺旋菌门含有丰富的具有硝化功能菌属(Miao et al., 2015)；热单胞菌属(Thermomonas)、Mangroviflexus、固氮螺菌属(Azospira)和丛毛单胞菌属(Comamonas)4个菌属的相对丰度被证明与TN去除率有显著相关性(范鹏宇等, 2018)；新近研究还发现了属于好氧或兼性好氧异养且具有反硝化功能的细菌种属, 目前已经鉴定的自养反硝化细菌包括脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrifican)和脱氮硫小螺菌(Thiomicrospira denitrificans)(黄娟等, 2007；Wang et al., 2012；Damashek et al., 2018).

本试验垂直潜流人工湿地中出现了变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 且在基质层相对丰度较高, 还发现了嗜氢菌属(Hydrogenophaga)、戴沃斯菌属(Devosia), 上述菌属被证明均与湿地脱氮有关(黄倩茹等, 2016), 这不仅从微生物的角度证明基质层主要承担着湿地脱氮任务, 佐证了潜流人工湿地COD、TN的去除主要发生在湿地系统中上部的结论(杨旭等, 2010), 也解释了随着湿地运行进入后期, 微生物群落日渐丰富、湿地去除效果趋于稳定的现象.据陈泓硕等(2020)研究, TN含量与革兰氏阴性菌相关性较强, 上述所提到的拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门、梭杆菌门和变形菌门均属于革兰氏阴性菌, 进一步证明了基质层与脱氮密切相关.人工湿地中主要的除磷细菌为不动杆菌属和假单胞菌属(孙磊等, 2020), 不动杆菌属为变形菌门, 根据物种丰度聚类热图, 本研究中虽发现了假单胞菌属, 但相对丰度较低, 这可能是导致湿地除磷效果不理想的一大原因.

3.2.2 微生物群落时空变化

从图 4可观察到, 湿地运行初期(T1、T2)的样品中相对丰度较高的属, 如弯杆菌属(Flectobacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium), 在运行后期(T3、T4)相对丰度不再保持优势, 而相对丰度较低的属, 如铁杆菌属(Ferribacterium)、新鞘氨醇杆菌属(Novospingobium), 在后期则呈现了较高的相对丰度.根据NMDS分析结果(图 5)和ANOSIM显著性分析可知, T1与T2群落差异并不显著(R=0.06286, p=0.144), 有一部分距离较近, 说明试验初期微生物群落结构相似, 未出现明显变化.但到试验后期, 即T3、T4时期出现明显的组内聚集与组间分离(R=0.4713, p=0.001), 说明随着时间的变化微生物群落结构也随之改变.

微生物群落结构时间变化明显是因为随着试验的进行, 菌群对所处理污水逐渐适应, 能更好地进行污染物吸收；且试验时间增加, 微生物相应也能进行正常的生命活动并加快繁殖, 直至群落结构逐渐成熟, 到此阶段, 湿地的去污效果逐渐趋于稳定.

由图 4按时间分为T1~T4四组, 通过纵向对比同一时间各组内7个样品, 可得样品1~7的微生物群落结构逐渐发生变化, 且样品1与样品2、样品3与样品4、样品5与样品6间各自差异较小, 从采样点位分布分析可以看出, 空间结构上距离较近的样品微生物群落结构更相似.

与时间上的群落结构变化明显有所差异, 本试验中微生物群落的空间结构基本没有变化, 其原因可能是垂直潜流人工湿地存在着污水自上而下的流动, 部分微生物可能会随着水流在基质层中的运动而运动, 故在空间结构上距离越近则越相似, 表现出逐渐变化的过程.

3.3 湿地水质净化效果与微生物群落间关系

为进一步厘清各水质指标与微生物群落之间的影响关系, 进行PCA分析(图 6), 结果表明, COD、DO对群落结构的影响最大, TN和氨氮对群落结构也有较大影响.PCA分析中两主成分贡献率加起来可达51.6%, 说明该结果具有一定的参考意义.微生物群落结构与COD相关性较大, 这是因为有机物为湿地异养微生物提供营养盐, 促进其生长与繁殖(何良菊等, 2004).在DO充足条件下, 整体还原态的基质中能形成氧化态的微环境, 有利于好氧、兼性微生物的繁殖, 同时湿地植物根区化为各种微生物提供了生境条件(黄娟等, 2007), 微生物种类得以增加, 有利于微生物对污染物的降解, 从而促进人工湿地净化效果.如前所述, 湿地微生物大多与氮去除过程相关, 湿地脱氮过程主要是依靠湿地微生物, 故TN与氨氮指标会影响到微生物群落结构.

若将湿地净化效果简单视为TN、TP、COD的去除率, 依据实验结果易得, 各指标去除率均在12月2日左右开始呈现出逐步上升趋势, 并最终在一段时间内趋于稳定.T2、T3的微生物采样时间分别为12月3日和12月20日, 从水质指标来看, 该时段去除率相对稳定, 湿地运行效果较好, 说明此时微生物生长处于稳定期.图 5中T2与T3之间基质微生物群落变化显著, 可能一定程度上受到了湿地换水(12月10日)的影响, 但此时段DO、pH进出水值相对稳定, 进一步表明微生物生命活动仍维持在较为稳定的状态, 并未因湿地换水影响其去污效果.因此, 可将湿地运行2周左右作为一个时间点重点控制以达到提高净化效果的目的.但此后去除率又有所下降, 可考虑人为投加相关优势菌群、补充碳源等, 保证微生物的生长繁殖, 进一步提高湿地净化效率.此外, 更有研究表明, 在植物根际土壤中微生物的数量比非根际土壤中多几倍及几十倍, 微生物的多样性会影响到人工湿地的去除效果, 而在人工湿地中根际微生物的丰富度和多样性因植物种类的不同而有所差异(涂月等, 2019).在冬季低温条件下, 选择性地合理种植如芦苇或适合当地水土环境的水生植物, 可维持湿地系统中根际微生物的多样性及稳定性, 进而达到提升湿地运行效果的目的.

4 结论(Conclusions)

1) 经低温垂直潜流人工湿地处理后, 各水质指标浓度呈现不同程度的下降, 并存在一定的滞后性.湿地对TN、COD的去除效果较好, 但对TP的去除效果不佳.冬季低温环境和低碳氮比进水条件在一定程度上制约了湿地的水质净化效果.

2) 湿地运行期间, 基质微生物群落结构在时空上发生显著变化, 相关物种的相对丰度在后期出现上升, 使湿地去除效果趋于稳定.革兰氏阴性菌门类众多和假单胞菌属相对丰度较低, 是TN去除效果较好和TP去除效果不佳的重要原因, 表明湿地净化效果与基质微生物群落的密切相关性.

3) COD、DO能给微生物提供碳源和良好的生境环境, 是影响基质微生物的主要因子；而氮含量因与脱氮微生物活跃度具有一定关系, 成为次要因子.基质微生物群落结构受湿地换水影响, 但其整体作用效果在湿地运行2周后趋于稳定, 建议将2周作为一个关键时间点, 同时辅以菌群、碳源的投入, 提升湿地运行效率.