2021, Vol. 41
[PDF全文]
2. 清华大学环境学院, 清华大学水质与水生态研究中心, 北京 100084;
3. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085
2. Center for Water and Ecology, School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084;
3. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085
氧四环素(Oxytetracycline, OTC)是常用的四环素类抗生素之一, 是一种复杂的两性离子大分子有机化合物.由于价格低廉, OTC被广泛用于陆生牲畜和水产养殖中.OTC在动物肠道中的吸收率很低, 其中30%~90%以母体化合物的形式排泄(Alcock et al., 1999).而污水处理厂传统工艺无法完全去除OTC或其他抗生素, 导致水环境中抗生素普遍检出, 这可能会引起环境微生物产生抗药性(Arabpour et al., 2016; Xu et al., 2016; Belkacem et al., 2017), 进而影响食品安全和人类健康(Li et al., 2019).
混凝/絮凝技术是常用的水处理工艺, 由于絮凝胶体对抗生素的吸附作用很弱, 因此, 该技术对抗生素的去除效果较差(Kooijman et al., 2020).高级氧化工艺对饮用水中抗生素的去除效果较好, 但成本较高(Anjali et al., 2019).锰氧化菌在海洋、河流、湖泊、土壤及饮用水厂的生物滤池中广泛存在(王冰清等, 2015), 其产生的生物氧化锰可对抗生素产生吸附和降解作用.生物滤池中的生物氧化锰通过覆盖在滤砂的表面可以很好地去除微量抗生素, 并且不会产生额外的抗性基因(Cai et al., 2020).据报道, 锰氧化细菌能够利用天然有机物作为唯一的C/N源进行生长, 并将二价锰离子氧化为生物氧化锰, 有效去除生物滤池中的二苯甲酮(BP-4)(Chang et al., 2018)；KMnO4预氧化联合锰氧化细菌能够很好地去除饮用水中的BP-4(Jian et al., 2019).目前生物氧化锰对抗生素的降解机制及抗生素对锰氧化细菌的分子生物学影响机制尚不明确, 因此本研究拟探究锰氧化细菌及其催化产生的生物锰氧化物(Biogenic manganese oxides, BMO)对OTC的去除机制及OTC对该菌功能基因表达的影响, 以期为水处理工程中利用微生物强化去除抗生素等微量污染物奠定理论基础.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 菌株和培养基本研究使用的细菌菌株是从浙江嘉兴某湿地分离出的假单胞菌Pseudomonas sp. QJX-1(QJX-1)(周娜娜等, 2014), 保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC), CGMCC序列号为6630.
本研究使用自制培养基培养菌株, 该培养基组成如下: 250 mg·L-1葡萄糖、500 mg·L-1 MgSO4·7H2O、60 mg·L-1 CaCl2·2H2O、5 mg·L-1 KH2PO4、22 mg·L-1 NH4Cl、0.5 mg·L-1 FeCl3·6H2O、0.5 mg·L-1 Na2MoO4·2H2O、0.5 mg·L-1 CuCl2·2H2O、0.5 mg·L-1 ZnSO4·7H2O、11.45 mg·L-1 MnCl2、0.05 mg·L-1 NiCl2·6H2O(国药集团化学试剂有限公司)、0.001 mg·L-1维生素B1(上海迈瑞尔化学技术有限公司)、0.001 mg·L-1维生素B12和0.001 mg·L-1生物素(中国甘肃养泰和生物科技有限公司).培养基使用前加入10 mmol·L-1的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)(上海迈瑞尔化学技术有限公司)将pH调节至7.2.文中无特殊说明的化学试剂均为分析纯.
配制方法: 首先配制浓缩40倍的储备液1(含有KH2PO4和NH4Cl)、浓缩1000倍的储备液2(含有维生素B1、维生素B12和生物素)和浓缩50倍的储备液3(含有FeCl3·6H2O、Na2MoO4·2H2O、CuCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O和NiCl2·6H2O), 放于4 ℃冰箱中保存.储备液3配置方法如下: 在酸化(盐酸调节pH到3.0)的超纯水中缓慢加入FeCl3·6H2O以抑制Fe(Ⅲ)的水解, 然后添加其他金属元素, 并在添加每种金属元素之前确保其它已添加的金属元素已经充分溶解, 未发生沉淀.上述组分中葡萄糖、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O置于灭菌锅中进行高温灭菌(115 ℃, 25 min), 放置于室温后在洁净台中用Ф25/0.22 μm孔径的一次性预灭菌针头式过滤器(JETBIOFIL洁特, 中国)过滤添加储备液1、储备液2、储备液3、MnCl2和HEPES.
2.2 QJX-1的活化与培养初始QJX-1菌种保存在固体培养基平板上(4 ℃冰箱), 使用时挑取单个菌落在自制培养基中活化.以下操作均在无菌洁净台中进行: 在250 mL锥形瓶中添加100 mL的自制培养基, 用接种环从固体培养基上挑取单个菌落接种到上述培养基中.将锥形瓶用无菌封口膜密封后置于摇床中振荡培养48 h(170 r·min-1, 30 ℃), 然后取10 mL菌液接种到含90 mL新鲜自制培养基的锥形瓶中继续培养24 h, 将该菌液用作后期培养的接种源, 接种量为10%(V/V).所有实验如无特殊说明均设3次重复.
2.3 生物氧化锰对OTC的去除锰氧化菌接种48 h时(已出现锰氧化现象), 将OTC(98%, 上海腾准生物科技有限公司)加入培养基(5 μg·L-1)中, 然后振荡培养288 h(170 r·min-1, 30 ℃).在锰氧化菌接种后的0、24、48、72、96、120、144、168和288 h取样测定菌密度(OD600), 取200 μL菌液于96孔透明酶标板(JETBIOFIL洁特, 中国)中, 用SparkTM 10M酶标仪(Tecan, 瑞士)进行测定, 并通过流式细胞仪(BD, 美国)单染色法确定48、72、96、120和144 h后细菌的生长变化情况.Mn2+浓度利用电感耦合等离子体光谱仪(G8015A, 安捷伦5110 VDV)测定.QJX-1形貌采用JSM7401型场发射扫描电镜(FE-SEM, 日本株式会社)进行表征.OTC浓度的测定采用三重四极杆线性离子阱液质联用系统(QTRAP 5500 LC-MS/MS, AB Sciex液质联用仪, 美国).在相同条件下, 以不添加OTC的培养基作为对照.
为了确定BMO在OTC去除中的作用, 将5 L含Mn2+的QJX-1菌液培养(170 r·min-1, 30 ℃)288 h后离心, 收集BMO沉淀进行冷冻干燥.将干燥后的BMO分别加入到含5 μg·L-1和50 μg·L-1 OTC的水溶液中进行培养(170 r·min-1, 30 ℃), 288 h后测定水溶液中OTC的浓度.为了确定吸附和氧化作用在BMO去除OTC中的相对贡献, 在反应288 h后的BMO悬浮液中加入抗坏血酸, 待BMO完全溶解后再次测定水溶液中OTC的浓度.此外, 将5 μg·L-1和50 μg·L-1的OTC与QJX-1(不含锰)分别混合培养(170 r·min-1, 30 ℃)288 h后测定OTC的浓度以确定活细菌对OTC的去除作用.为了确定菌体吸附在OTC去除中的作用, 离心收集QJX-1细菌进行冷冻干燥, 分别加入到5 μg·L-1和50 μg·L-1的OTC水溶液(不含锰)中, 在170 r·min-1和30 ℃条件下反应288 h后测定OTC浓度.
2.4 RNA-Seq测定和多铜氧化酶基因cumA的扩增将QJX-1接种到(不)含5 μg·L-1 OTC的自制培养基(含5.0 mg·L-1Mn2+)中培养.以加入OTC的样品瓶作为实验组, 不加入OTC的样品瓶作为对照组, 每组3个生物学平行, 在24、48、72、96、120和168 h时分别取样.每次取样后将样品离心(10000 r·min-1, 5 min), 然后将菌体沉淀放入液氮速冻, 之后放入-80 ℃冰箱保存直至送样.
使用TRNzol Universal总RNA提取试剂(DP424, 北京天根生化科技有限公司)提取细菌样品(n=3)总RNA, 提取后的RNA样品检测合格后使用NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina构建原核转录组文库.文库检测合格后进行高通量测序(擎科生物, 中国).另外, 将提取的总RNA逆转录成cDNA, 然后对cumA进行扩增, 扩增引物为: CumAIdg2B, 5′-GAYGCCGGYAGCTACT GGTAYCACCC-3′；CumAIdgR, 5′-ACYTTGAARSY CATGCCRTGCARRTG-3′(Sambrook et al., 2001; Francis et al., 2001).实验数据采用Friedman检验和事后LSD(Least significant difference)检验等方法分析样品之间的差异性, RNA-Seq测序数据的获取号为PRJNA720575.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 QJX-1的生长与适应菌密度(OD600)变化规律如图 1a所示, 在48 h之前, 未加入OTC时, 实验组与对照组的QJX-1生长趋势无较大差异.在0~24 h内, QJX-1的数量急剧增加；24~48 h期间, 实验组与对照组的QJX-1数量略有下降.实验组中加入OTC后, QJX-1数量再次增加.为了排除细菌外泌物对菌密度测定的干扰, 通过流式细胞仪对实验组与对照组的细菌进行直接计数(图 1b).结果表明, 添加OTC后实验组中的细菌数量增加, 并且大于对照组中的细菌数量, 这说明OD600再次上升不是外泌物增加导致的.该结果表明微量的OTC对QJX-1没有毒害作用, 反而促进了细菌的生长, 这与Chang等(2018)报道的BP-4对QJX-1没有毒害作用, 反而促进了细菌的生长的现象相似, 该研究指出BP-4通过刺激酪氨酸的代谢, 加快QJX-1对酪氨酸的消耗, 进而促进QJX-1的生长.另外, Mn2+浓度的结果表明(图 1c), 在对照组中, 120 h时Mn2+的浓度由初始的5 mg·L-1降至0 mg·L-1；而实验组中Mn2+浓度在72 h时已经降至0 mg·L-1, 表明实验组中Mn2+氧化速率显著提高, 进一步证明微量OTC的添加促进了QJX-1的生长, 进而促进了Mn2+转化为BMO.卢腾飞(2010)报道, 锰氧化菌氧化Mn2+的过程不是简单的生物直接氧化或者化学间接氧化, 而是生物化学耦合作用, 微生物的生长调控了溶液中的氧化还原环境, 促进了锰氧化物的生成.常洋洋(2017)在BP-4促进QJX-1锰氧化的机理研究中表明, BP-4加速了酪氨酸的消耗导致超氧化物的上调, 导致机体对饥饿效应的响应提前发生, 可能是BP-4加速Mn2+氧化的原因.
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| 图 1 OTC对QJX-1生长(a)、数量(b)的影响及添加OTC对QJX-1诱导锰氧化过程的影响(c) (pH=7.2, 温度(30.0±0.2) ℃, 反应时间288 h) Fig. 1 The effect of OTC on the growth(a) and quantity (b) of QJX-1and the effect of adding OTC on the process of QJX-1 induced manganese oxidation(c)(pH=7.2, T=(30.0±0.2) ℃, t=288 h) |
为探究QJX-1及其生物氧化锰对OTC的去除情况, 将OTC于48 h时分别添加到(不)含有Mn2+的培养基中, 利用LC-MS/MS对不同时间点样品的OTC浓度进行测定, 结果如图 2a所示.在有生物氧化锰生成的实验组中, 48~72 h期间OTC的去除速率最快, 该阶段QJX-1数量增多, Mn2+被完全氧化；72~144 h期间OTC浓度稳定下降, 同时QJX-1数量逐渐下降；288 h时OTC被完全去除.在无Mn2+的对照组中, OTC浓度基本不变, 表明QJX-1细菌本身对微量的OTC的去除效果不明显, 这与常洋洋(2017)关于QJX-1及其生物氧化锰对BP-4的去除作用结果一致, 表明BMO在去除OTC中发挥了重要作用, 这与Furgal等(2015)报道“BMO在污染物去除过程中起着很大的作用, BMO可以完全去除污水中的类固醇激素雌酮和17-a炔雌二醇”的结论相符.
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| 图 2 QJX-1及其生物氧化锰对OTC的去除(a)及去除机制(b) (pH=7.2, 温度(30.0±0.2) ℃, 反应时间288 h) Fig. 2 Removal of OTC by QJX-1 and its biogenic manganese oxides (a) and removal mechanism (b) (pH=7.2, T=(30.0±0.2) ℃, t=288 h) |
BMO具有很好的吸附氧化能力, 为了确认吸附和氧化作用在去除OTC过程中分别发挥的作用, 本研究从培养基中分离了BMO单独考察其对OTC的去除(图 2b).结果表明, 初始浓度为5 μg·L-1和50 μg·L-1的OTC分别与1.0 g的BMO反应288 h后, 溶液中OTC浓度分别为0.015 μg·L-1和11.155 μg·L-1, 经计算得BMO对OTC的去除量分别为0.4985 μg·g-1和3.8845 μg·g-1.加入抗坏血酸溶解BMO后的OTC浓度分别为4.765 μg·L-1和38.165 μg·L-1 (图 2b), 经计算得BMO对OTC的吸附量分别为0.475 μg·g-1和2.701 μg·g-1, 对OTC的氧化去除量分别为0.0235 μg·g-1和1.1835 μg·g-1.在OTC浓度较高(50 μg·L-1)时, 吸附和氧化作用都扮演着重要角色；在OTC浓度较低(5 μg·L-1)时, 吸附作用占主导.无论OTC浓度高低与否, 活/死细菌对OTC的去除作用均很小.综上可得, QJX-1及其生物氧化锰对不同浓度OTC的去除效果存在差异, 该研究结果与田雨等(2018)的结果类似, 田雨等(2018)在锰氧化菌对双氯芬酸、萘普生、乙炔基雌二醇的去除研究中发现, 当去除率分别为100%、65.5%和100%时, 其中生物氧化锰吸附贡献的去除率分别为75.5%、35.7%和78.3%, 表明吸附与氧化均发挥作用, 但贡献比例与物质结构及浓度有关.
3.3 QJX-1中ABC转运蛋白相关基因表达的改变在革兰氏阴性菌中, ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白是形成外排泵的一部分和跨越整个细胞膜并介导外膜转运的组件, 它能排出菌体中的抗生素并从革兰氏阴性菌中输出毒力因子(Greene et al., 2018).在分析不同培养时间(未)添加OTC的QJX-1基因表达水平差异时, 发现pstA、pstB、pstC、urtA和urtD等ABC转运蛋白基因的丰度发生了显著变化(图 3).pstA、pstB和pstC基因在72 h和96 h时显著升高(p < 0.001, n=3), urtA和urtD基因在96、120和168 h时呈显著升高的趋势(p < 0.001, n=3), 说明这些基因在排出细胞内的OTC时起着重要作用.Guillaume等(2015)的研究表明, 转运蛋白形成的外排泵可以以牺牲一个质子为代价从细胞内部排出四环素.因此, OTC可能是通过ABC转运蛋白泵出QJX-1体内, 进而让BMO更有效地接触OTC, 达到OTC被吸附、氧化去除的目的.
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| 图 3 不同培养时间的ABC转运蛋白基因转录水平差异 (OTC添加与未添加时基因表达水平比值, 采用Friedman检验和事后LSD检验方法计算p值, **p<0.01, ***p<0.001, 无显著差异(p≥0.05)的数据未显示) Fig. 3 Differences in ABC transporter gene transcriptional levels at different culture times(Use Friedman test and post-mortem LSD test to calculate the p value, ***p<0.01, ***p<0.001, Data with no significant difference (p value ≥0.05) is not shown) |
多铜氧化酶被认为是锰氧化模式菌锰氧化活性的必需成分(Corstjens et al., 1997; Brouwers et al., 1999; Tebo et al., 2001;Ridge et al., 2007; Dick et al., 2008), 因为编码多铜氧化酶的基因受损会导致其丧失锰氧化活性.未添加OTC和添加OTC后QJX-1中多铜氧化酶相关的基因(cumA)表达丰度如图 4所示.cumA基因在48、72、96和120 h时显著升高(p < 0.001, n=3), 表明OTC的添加促进了cumA基因的表达, 增强了锰氧化活性, 进而加速了BMO的生成.常洋洋等(2017)的研究表明, BP-4的加入并没有明显提高cumA基因的相对丰度, 但促进了超氧化物和过氧化氢的产生, 这可能是锰氧化提前发生的原因.由此可见, BP-4和OTC促进QJX-1锰氧化的作用机理不同, 不同结构类型微量有机污染物对锰氧化细菌的生长和作用机理还待深入研究.
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| 图 4 OTC对QJX-1 cumA基因表达量的影响 (采用双尾非配对T检验方法计算p 值, ***p < 0.001) Fig. 4 Copy number of cumA gene at different time points in QJX-1 with and without OTC(Two-tailed unpaired T test method was used to calculate the p value, ***p < 0.001) |
1) 微量OTC的添加可促进QJX-1的生长及其对Mn2+的氧化, QJX-1及其生物氧化锰在第288 h时可100%去除OTC.
2) 微量OTC的加入导致细菌中pstA、pstB、pstC、urtA和urtD等ABC转运蛋白基因表达上调, 表明这些基因在泵出QJX-1细胞内的OTC时起着重要的作用, OTC可能是通过ABC转运蛋白泵出QJX-1体内.
3) 微量OTC的添加促进了QJX-1中多铜氧化酶基因的表达, 进一步证明了微量的OTC可促进细菌对Mn2+的氧化和生物氧化锰的形成, 进而有利于OTC的去除.
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