1 引言(Introduction)

生物脱氮是废水中氮素去除的主要途径, 传统生物脱氮过程中, 硝化作用与反硝化作用分别在好氧和厌氧条件下进行, 要求脱氮体系至少需要一个好氧池和一个厌氧池, 存在水力停留时间长和构筑物成本高等弊端.异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HNAD)细菌可以使硝化和反硝化作用同时在好氧条件下完成.近年来, 越来越多的HNAD细菌被分离报道, 如假单胞菌属(Pseudomonas)(He et al., 2019)、芽孢杆菌属(Bacillus)(Rout et al., 2017)、脱氮副球菌属(Paracoccus)(Jaffer et al., 2019)等, 但目前对HNAD细菌的研究主要集中于脱氮效率、条件优化和含氮气体组成等方面, 关于HNAD细菌的动力学研究较少.对功能菌株生长及氮素去除动力学模型的研究, 可以深入了解菌株的生理特性, 为菌株的扩大培养和工程实践提供理论指导.

前期课题组筛选获得了脱氮效果良好的HNAD细菌Acinetobacter junii WZ17, 本文通过“样条插值法(spline interpolation method)”对菌株的生长阶段进行划分；并对Logistic方程进行优化, 建立菌株WZ17生长动力学基本方程, 利用修正的Gmopertz模型拟合菌株脱氮特性, 得到氮素去除过程的详细参数, 用于描述和预测菌株生长性能和脱氮效率, 为反应的放大提供参数支持.

2 实验材料与方法(Materials and methods) 2.1 菌株来源

Acinetobacter junii WZ17由本课题组(温州大学环境微生物技术实验室)筛选获得, 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心, 编号：GCMCC17130.

2.2 培养基

异养硝化培养基(1 L, pH为7.4)包含0.5 g (NH₄)₂SO₄, 6.8 g乙酸钠和50 mL维氏盐溶液.

硝酸盐培养基(1 L, pH为7.4)包含0.72 g KNO₃, 6.8 g乙酸钠和50 mL维氏盐溶液.

亚硝酸盐培养基(1 L, pH为7.4)包含0.49 g NaNO₂, 6.8 g乙酸钠和50 mL维氏盐溶液.

维氏盐溶液配方为1 L溶液中含5 g K₂HPO₄, 2.5 g MgSO₄·7H₂O, 2.5 g NaCl, 0.05 g FeSO₄·7H₂O和0.05 g MnSO₄·4H₂O

2.3 生长动力学 2.3.1 菌株生长阶段的划分

以培养24 h的菌液为种子液, 按0.5%(体积比)接种于100 mL培养基中, 于26 ℃、160 r·min^-1振荡培养48 h(溶解氧为5.2 mg·L^-1).前4 h每隔1 h取样, 之后每隔4 h取样测定OD₆₀₀(细菌培养液在600 nm波长处的吸光值, 描述细菌细胞密度).采用“样条插值法”对实验数据进行处理, 得到连续可导的光滑曲线, 对时间t分别求一阶导和二阶导, 得出菌株的瞬时生长速度和瞬时生长加速度(申秋璇, 2012; Chen et al., 2016).根据数学意义, OD₆₀₀最大值点为V_inst趋于零的点, OD₆₀₀拐点为V_inst的最大值点和V_acce趋于零的点, V_inst拐点为V的最大值点.

2.3.2 菌株世代时间

在分批培养中, 处于对数生长期的菌株符合下列方程：

(1)

对式(1)积分, 可得

(2)

(3)

当菌体倍增时, 可得

(4)

联立式(3)、(4)可得

(5)

式中, X为菌体浓度, 即OD₆₀₀；μ为比生长速率(h^-1)；t为菌株世代时间(h).

2.3.3 生长动力学模型

运用Logistic方程拟合菌株生长曲线, Logistic(汤琳等, 2004)原始方程：

(6)

式中, μ_max为最大比生长速率(h^-1)；X为t时刻菌体浓度；X₀为初始菌体浓度；X_max为最大菌体浓度；t为培养时间(h).

对式(6)积分可得：

(7)

由式(7)得菌体浓度X和时间t的函数关系：

(8)

2.4 去除动力学

以培养24 h的菌液为种子液, 按0.5%(体积比)接种于100 mL培养基中, 于26 ℃, 160 r·min^-1振荡培养48 h, 前4 h每隔1 h取样, 之后每隔4 h取样, NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N浓度均以8000 r·min^-1, min后检测.

采用修正的Gompertz模型(Chen et al., 2016)(式(9))对底物去除过程进行拟合, 确定底物浓度与去除时间的关系.

(9)

式中, S为t时刻底物浓度(mg·L^-1)；S₀为初始底物浓度(mg·L^-1)；R_m为最大去除速率(mg·L^-1·h^-1)；t₀为迟滞时间(h).

2.5 分析方法

NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^--N浓度均采用标准方法测定(国家环境保护总局, 2002)；胞内氮含量的估算参照Wang等(2012)和Zhao等(2018b)的方法进行.在100 mL培养基中, 按0.5%(体积比)接种细菌, 于26 ℃, 160 r·min^-1的条件下培养.设置4、8、12、16、20、24、28、36、42和48 h共10组实验, 菌液在4 ℃、12000 r·min^-1条件下离心15 min后用纯水冲洗3次, 离心产物在105 ℃烘箱中干燥至恒重.将处于生长期的细胞干重W与OD₆₀₀进行拟合, 得到方程如下：

(10)

式中, W为细胞干重(mg·L^-1)；X为菌体浓度, 即OD₆₀₀.

根据细菌的化学简式C₅H₈O₂N对细胞干重的氮含量W_N进行估算, 菌株WZ17细胞干重中氮含量与OD₆₀₀的关系如下：

(11)

式中, W_N为胞内氮的含量, 即同化的氮(mg·L^-1).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同碳源对菌株WZ17去除氨氮的影响

分别以甲醇(CH₃OH)、葡萄糖(C₆H₁₂O₆)、乙酸钠(C₂H₃O₂Na)、丁二酸纳(C₄H₄Na₂O₄)和碳酸钠(Na₂CO₃)为唯一碳源配置异养硝化培养基, 不同碳源之间进行含碳量等摩尔替换, 以不添加碳源为对照组.不同碳源对菌株WZ17生长和脱氮效率的影响见图 1a.菌株在以碳酸钠为唯一碳源和不添加碳源的培养基中均不生长, 也不能去除NH₄⁺-N, 说明菌株WZ17无法利用无机碳源, 与其他文献报道的不动杆菌属为异养菌的结论一致.葡萄糖作为最常用的碳源, 多数异养硝化细菌如Bacillus subtilis A1(Yang et al., 2011)、Pseudomonas stutzeri A1-1(文屹, 2010)和Providencia rettgeri strain YL(Zhao et al., 2010)均可利用葡萄糖, 而菌株WZ17以葡萄糖为碳源时, 生长缓慢, NH₄⁺-N去除率仅为7.78%.以乙酸钠和丁二酸钠为唯一碳源时, 经24 h培养, OD ₆₀₀分别达到1.495和1.179, NH₄⁺-N去除率均达90%以上.菌株WZ17对乙酸钠和丁二酸纳的利用情况较好, 可能是因为这两种物质均属于羧酸盐, 直接参与三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle, TAC), 利用和产能途径更短；相比于丁二酸纳, 乙酸钠的分子结构更加简单, 与微生物优先选用分子量更小的有机物作为碳源的结论相符(陈茂霞等, 2013).

为研究菌株WZ17脱氮过程中对有机物的去除情况, 以乙酸钠作为有机物来源, 对培养基中NH₄⁺-N浓度和COD进行拟合, 结果如图 1b所示, NH₄⁺-N和COD有较好的相关性, R²=0.989, COD和NH₄⁺-N同时以平衡的速率被去除, 说明碳源是菌株生长和脱氮的必要条件(Lee et al., 2003).

3.2 不同氨氮浓度对菌株WZ17生长及脱氮效率的影响

NH₄⁺-N作为菌株生长的氮源和硝化作用的底物, 其浓度过低, 不能满足菌株生长需求, 浓度过高, 则会在反应体系中产生游离氨(FA), 抑制菌株硝化作用(Anthonisen et al., 1976).分别设置初始NH₄⁺-N浓度梯度为100、200和400 mg·L^-1(实际分别为102.28、206.76和375.26 mg·L^-1), 菌株WZ17的生长及NH₄⁺-N去除曲线如图 2所示, NH₄⁺-N起始浓度为100 mg·L^-1时, 28 h内去除率为98.68%, 远高于菌株Bacillus subtilis A1(36.3%, 120 h)(Yang et al., 2011)和Pseudoxanthomonas sp.C2(78.87%, 24 h)(郝明辉等, 2016)；NH₄⁺-N起始浓度为200 mg·L^-1时, 48 h内去除率为87.39%, 而菌株Acinetobacter sp.YN3在NH₄⁺-N浓度为200 mg·L^-1时, 几乎不能生长(颜薇芝等, 2017)；当NH₄⁺-N浓度升高至400 mg·L^-1时, 去除率仍超过60%(66.10%), NH₄⁺-N去除率随浓度升高而降低的现象与Yang等(2011)的研究结果一致.上述结果表明, 菌株WZ17脱氮效果优良, 具有处理高浓度NH₄⁺-N废水的应用价值, 如养猪场废水、垃圾渗滤液和焦化废水等.

3.3 菌株WZ17异养硝化过程研究 3.3.1 菌株WZ17异养硝化过程生长阶段划分

以往对微生物生长过程的研究, 多使用观察法来划分生长阶段, 由比浊法测得的OD₆₀₀是一定时间内菌株生长积累量的均值, 与取样时间有关, 而瞬时生长速度V_inst和瞬时生长加速度V_acce可以反映微生物在生长过程中的动态变化, 准确地对生长阶段进行划分, V_inst和V_acce采用origin 8.0“样条插值法”进行计算, 结果见表 1.本方法对微生物生长过程中所涉及的数学问题进行深入分析, 是研究微生物生长特性方面的一个创新性的探索.由表 1可知, 在接种后的2.89 h, V_acce达到最大值, 菌株由生长适应期(Ⅰ)进入对数生长期(Ⅱ)；在8.20 h, V_inst达到最大值, 此后开始下降, 菌株进入减速生长期(Ⅲ)；在28.46 h, V_inst趋近于0, 此后菌株进入衰亡期(Ⅳ).该方法的应用, 将传统微生物生长阶段划分的准确性提升了一个数量级.菌株WZ17各生长阶段划分如图 3所示.

3.3.2 菌株WZ17异养硝化过程生长世代时间

世代时间(Generation time, G)能够反映细菌的增殖速率, 是评价菌株适应性的重要指标(张姣惠等, 2019), 然而用于描述微生物生长的Logistic方程等众多S形生长方程均未给出“世代时间”这一参数.根据“菌株在对数生长期的代时是稳定的(杨国良等, 2016)”这一性质, 将菌株在对数生长期的OD₆₀₀与时间t进行非线性拟合, 可以得出菌株WZ17硝化过程的世代时间.

根据式(3)对菌株WZ17对数生长期OD₆₀₀与时间t进行非线性拟合, 得

(12)

菌株WZ17以NH₄⁺-N为唯一氮源时, 比生长速率μ为0.389 h^-1, 高于菌株Alcaligenes faecalis NR(0.16 h^-1)(Chen et al., 2016), 与Pseudomonas putida NP5(0.41 h^-1)(Yang et al., 2019)相当, 比传统自养硝化细菌(0.03~0.05 h^-1)(张自杰, 2000)高出一个数量级；由式(5)得世代时间为1.78 h, 短于Mi-crobacterium YX1(3.03 h)(李伟光, 2014)和Pseudomonas stutzeri SRO 2(2.65 h)(张多英, 2011), 说明菌株WZ17具有较强的分裂增殖能力, 可以更早地进入底物去除阶段.

3.3.3 菌株WZ17的异养硝化动力学

虽然Logistic方程适用于存在最大细胞浓度限度的微生物生长模型, 然而Logistic原始方程(6)仅描述了微生物比生长速率μ与时间t的关系, 本文对Logistic方程进行优化, 以OD₆₀₀为生物量指标, 构建菌体浓度X、瞬时生长速度V_inst与时间t的关系.初始NH₄⁺-N浓度为100 mg·L^-1时, 根据式(8)对菌体浓度X和时间t的拟合结果如图 4a所示, 菌体浓度X与时间t的方程为：

(13)

式(13)对t求导, 得菌株WZ17的瞬时生长速度V_inst与时间t的关系, 见式(14).

(14)

图 4b为Gompertz模型对NH₄⁺-N去除曲线的拟合, R²为0.995, NH₄⁺-N最大去除速率为8.47 mg·L^-1·h^-1, 高于菌株Klebsiella sp. TN-10(3.02 mg·L^-1·h^-1)(Li et al., 2019)和Klebsiella pneumonia CF-S9(4.3 mg·L^-1·h^-1)(Padhi et al., 2013).

3.3.4 菌株WZ17的异养硝化过程研究

菌株WZ17在26 ℃、pH为7.4和160 r·min^-1培养条件下, 异养硝化过程各组分浓度变化如图 5所示, NH₄⁺-N在28 h内去除率达到98.68%, 胞内氮由0.45 mg·L^-1增加到26.51 mg·L^-1(由式(11)得出), 占初始氮量的25.78%, 胞内氮含量远低于异养硝化菌株Pseudomonas putida YH(53%)(王旭辉等, 2019), 可知硝化作用为菌株WZ17的主要脱氮形式.NO₃^--N和NO₂^--N均从反应发生时开始积累, NO₃^--N在8 h达到最大积累量0.13 mg·L^-1, 低于菌株P. stutzeri XL-2(4.0 mg·L^-1)(Zhao et al., 2018a), 此后逐渐降低, 在28 h从体系中完全去除, 说明硝化作用的产物可作为反硝化作用的底物被利用, 初步证明菌株WZ17具有同步硝化反硝化的功能；NO₂^--N在12 h达到最大积累量0.13 mg·L^-1, 与NH₄⁺-N达到最大去除速率的时间一致, 说明NO₂^--N为硝化过程的主要产物, 此后NO₂^--N含量逐渐降低, 在28 h达到最低值0.04 mg·L^-1.NO₂^--N含量出现先升后降再升的趋势, 是由于前期体系中NH₄⁺-N含量充足, 以硝化作用为主, NO₂^--N出现累积, 随着反应进行, NH₄⁺-N浓度逐渐降低, 体系中以反硝化作用为主, NO₂^--N被还原(许涛, 2018), 28 h后NO₂^--N和NH₄⁺-N浓度均有所增加, 结合图 3可知, 菌株在28 h后进入衰亡期, 表明菌株在衰亡期对氮素的释放以NO₂^--N和NH₄⁺-N为主.

3.4 菌株WZ17的好氧反硝化过程研究 3.4.1 以NO₃^--N为唯一氮源

为研究菌株WZ17以NO₃^--N作为唯一氮源时的生长特性, 在初始NO₃^--N浓度为100 mg·L^-1时, 同3.3.1节, 对菌株WZ17生长阶段进行划分(图 6a), 经过3.13 h的生长适应期(Ⅰ)后, 菌株进入对数生长期(Ⅱ), OD₆₀₀从0.0078迅速增加到0.63；在7.95 h, 瞬时生长速度V_inst达到最大值, 随后进入减速生长期(Ⅲ)；在25.56 h, V_inst趋近于0, OD₆₀₀达到最大值1.401, 此后, 菌株WZ17进入衰亡期(Ⅳ).

菌株WZ17以NaNO₃为唯一氮源进行好氧反硝化时, 各组分随时间的变化如图 6b所示, NO₃^--N浓度从101.29 mg·L^-1降低至11.09 mg·L^-1, 去除率为89.05%.NO₃^--N最大去除速率为5.76 mg·L^-1·h^-1, 高于K. pneumoniae CF-S9(2.2 mg·L^-1·h^-1)(Padhi et al., 2013)和Rhodococcus sp. CPZ24 (0.93 mg·L^-1·h^-1)(Chen et al., 2012).NH₄⁺-N和NO₂^--N的积累量均在8 h达到最大值, 分别为2.63和1.55 mg·L^-1, He等(2016)报道的反硝化过程也有少量NH₄⁺-N积累, 认为是部分NO₃^--N转化所致(Van et al., 1992).后续NH₄⁺-N浓度持续增加, 结合图 6a可知, 24 h后菌株进入衰亡期发生自溶, 所释放的有机氮被转化为NH₄⁺-N(杨垒等, 2020).

3.4.2 以NO₂^--N为唯一氮源

以NO₂^--N为唯一氮源时, 同3.3.1节, 对菌株WZ17生长阶段进行划分(图 7a), 经过3.13 h的生长适应期(Ⅰ)后, 菌株进入对数生长期(Ⅱ), OD₆₀₀从0.06迅速增加到0.62；在7.95 h, 瞬时生长速度V_inst达到最大值, 随后菌株进入减速生长期(Ⅲ)；在23.87 h, 菌株的V_inst趋近于0, 此后, 菌株WZ17进入衰亡期(Ⅳ).WZ17以NO₂^--N作为唯一氮源进行反硝化作用时, 各组分随时间的变化如图 7b所示, 结合图 7a可知, NO₂^--N的去除发生在菌株WZ17的对数生长期, 最大去除速率为5.16 mg·L^-1·h^-1, NO₃^--N从反应发生时即开始累积, 在8 h达到最大积累量2.02 mg·L^-1, 远小于菌株Defluvibacter lusatiensis str. DN7(21.83 mg·L^-1)(肖继波等, 2012).NH₄⁺-N同样在8 h达到最大积累量2.36 mg·L^-1, 随后其浓度逐渐降低, 这与颜薇芝等(2017)和Li等(2015)报道的反硝化过程中具有少量NH₄⁺-N积累一致, 24 h后, NH₄⁺-N浓度上升与菌株进入衰亡期有关(杨垒等, 2020).

相比于菌株Pseudomonas sp. yy7(Wan et al., 2011)在NO₂^--N浓度为50 mg·L^-1时停止生长, Pseudomonas putida Y-11(何腾霞等, 2015)在NO₂^--N浓度为100 mg·L^-1时, 去除率仅为40%, 菌株WZ17在NO₂^--N为浓度100 mg·L^-1时, OD₆₀₀可达1.363, 去除率为83.66%.研究表明, NO₂^--N可在溶液中产生游离亚硝酸(FNA), 抑制微生物的代谢.FNA浓度由式(15)计算(叶剑锋, 2006)：

(15)

本实验中, FNA浓度为0.029 mg·L^-1, 这已经达到了抑制菌体生命活动的浓度(Vadivelu et al., 2006; Jiménez et al., 2012), 表明菌株WZ17对高浓度NO₂^--N或FNA有较强的耐受性, 具有处理高浓度NO₂^--N废水的应用前景.

3.5 菌株WZ17生长及去除动力学分析

不同氮源下, 菌株WZ17的动力学参数如表 2所示, 以NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N为氮源时, 最大OD₆₀₀分别为1.518、1.401和1.363, 与最大去除速率和最终去除率一致, 表明菌株对NH₄⁺-N的利用优于NO₃^--N和NO₂^--N.

不同氮源下, 菌株WZ17的世代时间不同, 说明氮源种类会影响菌株的生长.在以NH₄⁺-N为氮源时, 世代时间最长, 比生长速率最小, 然而最大去除速率(8.47 mg·L^-1·h^-1)却高于以NO₃^--N为氮源(5.76 mg·L^-1·h^-1)和以NO₂^--N为氮源(5.18 mg·L^-1·h^-1), 可能是菌株WZ17的氨单加氧酶活性(AMO)高于好氧反硝化酶活性.

菌株对NO₂^--N的去除率(83.60%)低于对NH₄⁺-N的去除率(98.68%), 可能与菌株在进行反硝化时需要更高的C/N有关(王孟等, 2017).本研究中, 反硝化体系所用的C/N与硝化体系相同, 所以碳源不足可能是NO₂^--N去除率较低的主要原因.

NO₃^--N和NO₂^--N同为反硝化过程的底物, 菌株对NO₂^--N去除率(83.60%)低于NO₃^--N的去除率(91.82%), 可能与氧化还原电位有关, 相比于NO₂^--N, NO₃^--N的氧化还原电位更高, 更容易被微生物利用(李卫芬等, 2011), 并且印证了3.3.4节菌株异养硝化过程中, NO₃^--N积累后, 很快被去除的现象.

4 结论(Conclusions)

1) 利用“样条插值法”对试验数据进行处理, 通过研究菌株WZ17瞬时生长速度V_inst和瞬时生长加速度V_acce与细胞浓度OD₆₀₀的关系, 能准确地对菌株的生长阶段进行划分.

2) 菌株WZ17在24 h内对NH₄⁺-N的去除率高达98.68%, 并且以硝化作用为主.

3) 菌株WZ17能够以NO₂^--N和NO₃^--N为唯一氮源进行生长并去除氮素, 具有好氧反硝化特性, 以NO₃^--N为唯一氮源进行反硝化时, NO₂^--N为中间产物, 推测WZ17的反硝化途径为NO₃^--N→NO₂^--N→N_xO_y.下一步可从酶学角度或者功能基因层面对脱氮途径进行深入分析.

4) 采用Logistic方程和Gompertz分别拟合了菌株的生长和底物去除过程, 模型相关系数R²均在0.9以上, 相关参数可为反应的放大提供支持.