2021, Vol. 41
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2. 中国科学院大学, 北京 100000
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100000
随着集约化、规模化畜禽养殖业的蓬勃发展, 抗生素因在预防和治疗疾病、促进动物生长等方面发挥着重要作用而被广泛应用(张欣阳等, 2014).抗生素虽然能在动物体内进行新陈代谢, 但仍有75%的剂量以母体或代谢产物的形式通过粪便和尿液排出体外, 进入环境中(Chee-Sanford et al., 2009).抗生素在环境中的残留会对人类健康和生态环境产生风险, 尤其会诱发、传播和增加各类抗生素抗性细菌的耐药性(陈小丽等, 2018; Bengtsson-Palme et al., 2018).因此, 抗生素的去除是人们共同关心的问题.磺胺类抗生素是现代医学中一类常用的人工合成抗菌药剂, 其在环境中消减的重要途径是微生物降解(张欣阳等, 2014).
微生物降解法因其成本低、环境友好性等特点被广泛应用(贺德春等, 2011).白腐真菌在自然界中广泛存在, 可以引起木材呈白色腐烂, 其分泌的酶对有机物有很强的降解能力, 其中包括对抗生素的降解(Guo et al., 2014).黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysoporium)是一类典型的白腐真菌, 因其生物量大、对底物要求低以及对环境适应能力强等特点, 在微生物修复中受到众多研究者的关注(Tseng et al., 2014; Wang et al., 2019).目前对于黄孢原毛平革菌降解抗生素的研究, 大多数关注抗生素的降解效果、生物活性以及胞外酶活.张锦(2018)通过添加黄孢原毛平革菌对畜禽粪便中抗生素的去除效果进行研究, 结果表明其对土霉素和金霉素的去除率高达80%以上.在黄孢原毛平革菌降解抗生素的过程中, 关注较多的胞外酶是木质素过氧化酶、锰过氧化物酶和漆酶.Guo等(2014)在用黄孢原毛平革菌降解磺胺甲恶唑中发现, 漆酶在降解过程中其活性远高于木质素过氧化酶和锰过氧化物酶.王慧琴等(2016)研究了黄孢原毛平革菌对土霉素的降解效果和酶活, 当土霉素初始浓度为200 mg·L-1时, 降解率为67%, 且发现锰过氧化物酶起到关键作用.目前从基因水平上研究白腐真菌对有机污染物的降解相对较少.近年来, 转录组分析已被用于探索微生物降解途径(Maghsoudi et al., 2016; Liao et al., 2018).李艳鹏等(2020)基于转录组技术分析了铜绿假单胞菌对荧蒽的降解机理, 并且发现了在荧蒽胁迫条件下菌株的调控机制.Liao等(2018)利用转录组分析柠檬酸杆菌对2, 4, 6-三硝基甲苯降解, 发现了569个差异表达基因, 上调基因与氨基酸转运、细胞代谢和应激蛋白相关.但是目前从转录组学的角度分析黄孢原毛平革菌降解磺胺类抗生素的研究相对较少.
本研究以磺胺二甲氧嘧啶为研究对象, 研究了黄孢原毛平革菌对其降解效果, 并采用转录组学技术从分子水平层面分析黄孢原毛平革菌降解磺胺类抗生素的分子作用机制, 为抗生素生物修复技术的应用提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料 2.1.1 菌株黄孢原毛平革菌(CCTCC-AF96007)购于中国典型培养物保藏中心(武汉).菌株接种到PDA培养基上, 30 ℃培养5 d后, 放入4 ℃冰箱保存.将平板中孢子轻轻刮下, 8层纱布过滤, 用生理盐水制成孢子悬浊液(2×106个·mL-1).将孢子悬浊液加入到液体培养基中培养3 d(30 ℃, 150 r·min-1), 培养出菌丝球.菌丝球经纱布过滤后, 用生理盐水冲洗3次, 备用.
2.1.2 主要试剂及培养基磺胺二甲氧嘧啶钠盐(SDM)购自Sigma公司(纯度>99%).液体培养基(Tien & Kirk(T & K))(Tien et al., 1988)：每升培养基中含：葡萄糖10.0 g, 酒石酸铵0.2 g, 磷酸二氢钾2.0 g, 七水合硫酸镁0.75 g, 氯化钙0.1 g, 硫酸铜0.064 mg, 硫铵2 mg, 微量元素20 mL, 吐温80 g.微量元素每升含: 硼酸10 mg, 氯化钠1.0 g, 七水合硫酸亚铁0.1 g, 硫酸锰0.5 g, 七水合硫酸锌0.1 g, 氯化钴0.1 g, 二水合钼酸钠10 mg, 十二水合硫酸铝钾10 mg.
2.2 SDM降解试验试验组(AF)将6 g(湿重)菌丝球添加到含10 mg·L-1 SDM的T&K培养基中, 30 ℃、160 r·min-1培养4 d.灭活菌组(IF)将6 g(湿重)高压灭活菌丝球(121 ℃, 20 min)添加到含10 mg·L-1 SDM的T&K培养基中, 30 ℃、160 r·min-1培养4 d.对照组(CK)除不添加SDM外, 其他均与试验组保持一致.每组设立3个生物学重复.定期取样测定SDM含量, 测定方法参照课题组前期研究(Zhang et al., 2019).数据分析采用IBM SPSS统计软件包(版本23.0)和单因素方差分析(ANOVA)检验(Duncan检验).统计学分析, p < 0.05为显著性差异.
2.3 RNA抽提对于培养4 d后的试验组和对照组的菌株(每组3个生物学重复), 在4 ℃、10000 r·min-1条件下离心5 min收集菌体.总RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen)法, 并使用DNase I(TaKara)去除残留的DNA.分别采用2100 Bioanalyser(Agilent)、ND-2000(NanoDrop Technologies)方法检测RNA样品的质量, 以保证使用合格的样品(OD260/280=1.8~2.2, OD260/230≥2.0, RIN≥6.5, 28S: 18S≥1.0, >2 μg)进行转录组测序.
2.4 文库建立和测序对于试验组和对照组的RNA(每组3个生物学重复)进行文库的建立与测序.RNA文库的建立采用TruSeqTM RNA sample preparation Kit(Illumina, San Diego, CA)试剂盒.首先利用带有Oligo(dT)的磁珠从5 μg总RNA中富集有poly-A尾的mRNA.再加入fragmentation buffer, 将mRNA随机断裂成200 bp左右的小片段.接着采用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit(Invitrogen, CA)试剂盒、加入六碱基随机引物(Illumina), 以mRNA为模板反转合成一链cDNA, 随后进行二链合成, 形成稳定的双链结构.双链的cDNA结构为粘性末端, 加入End Repair Mix将其补成平末端, 随后在3′末端加上一个A碱基, 用于连接Y字形的接头.cDNA经过PCR富集后, 利用2%琼脂糖胶回收200~300 bp的条带.经TBS380(Picogreen)定量后, 文库使用Illumina HiSeq Xten/NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序, 测序读长为PE 150.
本试验中所用数据库包括NCBI蛋白非冗余数据库(non-redundant protein database, Nr), GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库.原始RNA测序数据已保存在NCBI的SRA(Sequence Read Archive)中, BioProject ID是PRJNA596337.
2.5 差异表达分析与功能富集为了识别两组不同样本之间的差异表达基因, 利用TPM(Transcripts Per Million reads)来计算基因表达量.在获得基因或转录本的表达量水平后, 利用DESeq2对不同试验组间基因差异表达进行分析.通过GO功能和KEGG通路显著性富集分析, 确定差异表达基因主要行使的生物学功能及参与的生化代谢途径, 分析黄孢原毛平革菌耐受和降解SDM的分子机理.
2.6 荧光定量PCR根据转录组差异分析结果, 选择显著性变化的4个差异表达基因进行qPCR验证, 内参基因选择gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因(Harmsen et al., 1992), 4个差异表达基因和内参基因的引物信息见表 1.基因的表达量依据2-ΔΔCt的方法来确定.试验中RNA为转录组同一批提取的样品, 每个试验组3个生物学重复.
| 表 1 qRT-PCR扩增引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR |
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为了研究菌株对SDM的吸附作用, 设置灭活菌株组(IF), 由图 1可以看出, 灭活菌株对SDM的去除率在24 h与96 h没有显著性差异(p>0.05), 去除率为19%, 表明菌体对SDM有一定的吸附作用.试验组(AF)黄孢原毛平革菌对SDM的去除率在第3 d达42%, 第4 d达到74%, 都显著高于灭活菌组(p < 0.05), 试验组第4 d的降解速率达3.24 mg·L-1·d-1.AF组和IF组在前24 h的去除率没有显著性差异(p>0.05), 说明在黄孢原毛平革菌培养初期(前24 h)以吸附为主, 随着培养时间的延长, 菌株代谢活性增强, 降解能力随之增强.
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| 图 1 黄孢原毛平革菌对SDM的降解(根据邓肯检验, 不同的小写字母表示处理组之间在5%水平上的统计差异) Fig. 1 Degradation of SDM by P. Chrysosporium (Different lowercase letters denote statistical differences between treatment groups at the 5% level according to Duncan′s test) |
利用Illumina高通量测序平台对降解SDM后的菌株进行转录组学测序, 表 2统计了本次转录组原始产出数据和进行质量控制后的数据.碱基质量值越高表明碱基识别越可靠, 碱基测错的可能性越小.通常Quality scores大于20(Q20%)即满足分析对测序质量的要求.碱基质量值Q越高, 说明测序错误率越低, Q值>20, 即认为碱基质量控制在可接受范围.CK组和AF组的碱基质量Q值基本在20%以上, CK组Q20%占了98.43%, SG组Q20%占了98.51%.所以, 此次的测序数据质量较好, 达到后续分析要求.
| 表 2 数据统计结果 Table 2 The statistic sequencing results of AF and CK group |
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根据p值< 0.05与|logFC|≥2的原则来筛选黄孢原毛平革菌降解SDM后与CK之间的差异表达基因.图 2表示的是黄孢原毛平革菌降解SDM后试验组与CK对照组转录组数据的差异表达基因分布图, 浅灰色点表示显著上调基因, 灰色点表示显著下调基因, 黑色点为非显著差异表达基因, 越靠近左上角或右上角表示下调或上调越显著.在处理SDM后, 黄孢原毛平革菌共获得了2511个差异表达基因, 其中1086个基因显著上调, 1425个基因显著下调.该数据结果说明, SDM处理改变了黄孢原毛平革菌的基因表达, 菌株可以通过部分基因的上调或下调来应对SDM的刺激, 维持细胞生长的正常进行.
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| 图 2 SDM处理组和不添加SDM对照组的差异表达基因火山图 Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed genes in SDM treated group and control group without addition of SDM |
为进一步揭示黄孢原毛平革菌对SDM代谢的功能响应, 对SDM处理组和CK对照组之间的差异表达基因进行了GO富集分析.通过GO功能分析, 可得到差异表达基因显著富集的GO term, 确定差异表达基因与生物学功能的密切关系.GO数据库将基因的功能分为3大类：生物学过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和细胞组分(Cellular component).根据差异表达基因的GO富集结果, 其中参与生物学过程、分子功能和细胞组分的差异表达基因比例为27%、70%和3%.
选取最显著富集的20个Go term进行分析(图 3), 差异表达基因数量最多的GO term属于生物学过程和分子功能.其中生物学过程分类中富集到最显著的差异表达基因与“多糖分解代谢过程”(polysaccharide catabolic process)有关, 含有17个差异表达基因.分子功能分类中富集到最显著的差异表达基因与“碳水化合物结合”(carbohydrate binding)和“氧化还原酶活性”(oxidoreductase activity)有关, 分别含有31、221个差异表达基因, 这些可能与SDM的降解有关.除此之外, 还显著富集到的GO terms有“复制分叉处理”(replication fork processing)和“对刺激的反应”(response to stimulus), 这些与菌株受到SDM的胁迫有关.显著富集的“NAD(P)+转氢酶活性”(NAD(P)+ transhydrogenase activity)可能与能量代谢有关.另外, 细胞组分中显著富集到“蛋白酶体调节”(proteasome regulatory particle), 这个结果说明菌株在降解SDM的过程中, 细胞组分中一些参与膜转运的基因会发挥作用, 参与SDM的识别, 协助SDM跨膜转运, 进而被降解.
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| 图 3 差异表达基因GO富集分析 Fig. 3 GO enrichment results of differentially expressed genes |
KEGG是描述代谢通路相关的数据库, 通过与KEGG数据库比对, 可以探索出生物体内的各种物质的代谢过程.因此, KEGG数据库中丰富的通路信息有助于从系统水平来研究黄孢原毛平革菌基因的生物学功能.KEGG富集分析能够确定差异表达基因所参与的生物学功能, 其中富集到的有4大类代谢通路.代谢(M)、细胞过程(CP)、遗传信息处理(GIP)和环境信息处理(EIP)4大代谢通路的差异表达基因所占的比例分别为65%、11%、20%和4%.图 4为试验组与对照组差异表达基因的KEGG通路富集图, 图中展示了与耐受和降解SDM有关的通路.
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| 图 4 差异表达基因KEGG富集分析 Fig. 4 KEGG enrichment results of differentially expressed genes |
在代谢通路中除了富集到糖类和氨基酸的代谢之外, 发现还富集到阿特拉津降解(Atrazine degradation)(属于外源生物降解与代谢(Xenobiotics biodegradation and metabolism)), ABC转运体(ABC transporters)和能量代谢相关的柠檬酸循环(Citrate cycle(属于TCA cycle))等通路.这些通路反映了黄孢原毛平革菌相关基因在耐受和降解SDM发挥的功能.
3.6 与耐受相关的基因分析通过对SDM处理后黄孢原毛平革菌的转录组分析, 发现一些显著上调的基因与菌株的耐性有关(表 3).表 3列出了15个与菌株耐受作用相关的基因.水通道蛋白, 细胞膜组分及ABC转运蛋白相关的基因高表达且显著性上调, 这主要与SDM的跨膜运输与转运相关.甲基转运酶, 谷胱甘肽巯基转移酶和热休克蛋白都是常见的与应激反应相关的解毒蛋白, 这些基因的显著性上调, 说明在SDM的降解中发挥了重要的作用.
| 表 3 黄孢原毛平革菌转录组中部分与SDM降解相关的差异表达基因 Table 3 List of significant difference genes of P. chrysosporium for between AF group and CK group correlated with resistance |
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表 4列出了高表达且差异倍数(FC)大于2.5的基因, 这些基因都与SDM的降解相关.与SDM降解相关的功能基因主要分为氧化还原和水解相关的基因.氧化还原相关的基因中乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、硝酸盐单加氧酶、细胞色素P450、乳酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、甲酸脱氢酶、多铜氧化酶基因等高表达且发生了显著的上调, 说明在SDM的降解中发挥了重要作用, 尤其是乙醇氧化酶基因, 上调了118倍.水解相关的基因中糖苷水解酶和碳水化合物酯酶基因发生的显著上调, 表明在SDM代谢过程中这两大类水解酶发挥着重要的作用.
| 表 4 黄孢原毛平革菌转录组中部分与SDM降解相关的差异表达基因 Table 4 List of significant difference genes of P. chrysosporium between AF group and CK group correlated with biodegradation |
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为了验证转录组数据的可靠性, 对试验组和对照组的RNA进行反转录, 选取了4个基因进行实时荧光定量PCR试验.试验组和对照组的基因的相对表达量利用2-ΔΔCt方法进行分析.结果表明, 试验结果与转录组测序结果一致(图 5), 均是上调, 这说明转录组测序结果的可靠性.
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| 图 5 转录组差异表达基因的qRT-PCR表达量验证 Fig. 5 qRT-PCR validation of differential expression profile obtained from RNA-seq |
本文对黄孢原毛平革菌降解磺胺甲噁唑进行研究, 4 d后SDM的去除率达74%, 降解速率达3.24 mg·L-1·d-1, 表明黄孢原毛平革菌能够有效降解SDM.Herzog等(2013)研究了假单胞菌(Pseudomonas spp.)、短波单胞菌(Brevundimonas sp.)、贪噬菌(Variovorax sp.)及细杆菌(Microbacterium spp.)对磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)的降解, 其降解速率为1.25~2.5 mg·L-1·d-1.因此, 黄孢原毛平革菌降解SDM具有一定的优势.在黄孢原毛平革菌降解初期(前24 h)效率较低, 以吸附为主, 可能是SDM抑制了菌株的生长与繁殖, 导致活性的降低.随着培养时间的增长, 菌株逐渐适应培养环境, 活性增强, SDM的去除效率增强.众多研究表明白腐真菌生物量大对有机物有一定的吸附能力, 这种生物吸附可对生物降解产生促进作用.丁洁等(2012)研究了黄孢原毛平革菌对多环芳烃的吸附降解作用, 发现吸附作用在前3 d达到平衡, 3 d后以降解为主; 并且发现吸附作用可以缩短污染物和菌株之间的距离, 从而提高多环芳烃的降解.因此黄孢原毛平革菌对SDM的吸附作用可能促进SDM后期的微生物降解.
黄孢原毛平革菌的转录组测序结果表明, SDM处理条件下的菌株(AF)与不添加SDM的对照组菌株(CK)的基因表达有很大的差异, 共有1086个显著上调基因和1425个显著下调基因, 说明SDM胁迫条件下黄孢原毛平革菌体内存在一个比较完整的适应系统, 通过调控一系列基因的表达来适应环境的改变.差异表达基因的GO富集分析表明, 显著富集到“氧化还原酶活性”相关的term与SDM的降解有关, KEGG富集到的“ABC转运体”相关基因与应激反应有关.这些富集分析结果都说明黄孢原毛平革菌的某些基因对SDM的耐受和降解发挥着作用.转录组测序分析结果显示, 在黄孢原毛平革菌降解SDM后出现1086个表达差异显著的基因, 这些表达差异的基因是研究黄孢原毛平革菌耐受和降解SDM机理的关键点.
在黄孢原毛平革菌的应激反应中, 与膜蛋白相关的水通道蛋白、细胞膜组分和ABC转运蛋白基因显著上调且高表达(p < 0.01)(表 3), 说明菌株可以通过调控SDM的跨膜运输, 来应对环境的变化.前人研究表明膜蛋白可以保护真菌免受各种形式的环境胁迫(Lushchak, 2011).ABC转运蛋白在大多数生物中是最大的膜蛋白家族之一, 它们在研究解毒和耐药性方面具有重要意义(Beis, 2015).甲基转移酶、谷胱甘肽巯基转移酶和热休克蛋白都是常见解毒酶, 它们的上调且高表达(表 3)说明这些基因在应激反应中发挥了重要的作用.甲基转移酶被认为具有甲基化解毒有机化合物的功能(Joshi et al., 1993).谷胱甘肽巯基转移酶是一种有名的解毒酶, 可促进谷胱甘肽过氧化物与环境污染物和药物等多种底物结合(Rabhi et al., 2019).Shen等(2015)证明了真菌的谷胱甘肽巯基转移酶基因可以增强菌株的抗氧化能力, 对抗氧化应激.热休克蛋白被普遍认为在应激反应中起着至关重要的作用, 一般在消除受损蛋白中发挥关键作用(Lindquist et al., 1988).
磺胺类抗生素的微生物降解, 目前推测的路径主要有：加氧氧化途径、脱硫途径、脱氮途径(Rodriguez-Rodriguez et al., 2012).SDM降解途径中, 氧化还原过程是微生物降解的关键步骤之一, 黄孢原毛平革菌降解SDM后, 一些与氧化还原作用和水解作用相关的基因发生了显著的变化, 这可能与降解SDM有着密切的联系.这些差异表达基因包括乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、硝酸盐单加氧酶、细胞色素P450、乳酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、甲酸脱氢酶及多铜氧化酶基因, 它们均高表达且显著上调(FC>2.5, p < 0.01)(表 4).乙醇氧化酶被普遍认为是真菌胞外H2O2产生的主要来源(Grinhut et al., 2011).Sun等(2015)和Chen等(2019)利用黄孢原毛平革菌降解四溴双酚A和芳香基染料, 均发现乙醇氧化酶基因显著上调, 表明在降解过程乙醇氧化酶中发挥重要的作用.本试验中乙醇氧化酶显著上调118倍, 说明其在SDM的降解中发挥着关键的作用.另外, 乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和乙醛脱氢酶都被报道与芳香化合物的微生物降解有关(徐泉, 2006; 刘玉华, 2015; Kameshwar et al., 2018), 它们都可以参与污染物的氧化还原反应.细胞色素P450是一种具有多种功能、多用途的生物催化剂, 能催化多种反应, 如羟基化、脱氢、环氧化和脱烷基反应(Isin et al., 2007).Monti等(2011)发现细胞色素P450能够将氧原子通过过氧化氢引入底物, 从而将芳胺官能团转化为亚硝基氧化状态.SDM是具有芳胺官能团的有机物, 因此SDM的芳胺官能团可能被细胞色素P450氧化.硝酸单加氧酶是一种黄素依赖性酶, 催化丙酸-3-亚硝酸酯和其它烷基亚硝酸酯的反硝化反应(Smitherman et al., 2013), 因此, SDM降解的反硝化脱氮途径可能与硝酸单加氧酶基因有关.多铜氧化酶家族有很多氧化酶, 其中最为典型的是漆酶, 可以参与磺胺类抗生素的脱硫降解反应(Garcia-Galan et al., 2011); 另外, 多铜氧化酶可能与过氧化氢的产生有关, 它可以通过类Fenton反应降解污染物(Garcia-Galan et al., 2011).糖苷水解酶和碳水化合物酯酶都属于水解酶, 可以参与木聚糖降解(周敏等, 2018), 这两类酶的高表达高上调说明在SDM可能存在糖苷水解酶和碳水化合物酯酶的水解作用.因此, 这些基因是黄孢原毛平革菌降解SDM的氧化还原、水解、脱硫和脱氮过程中的关键基因.
5 结论(Conclusions)黄孢原毛平革菌对SDM具有良好的去除效果, 4 d去除率达74%, 降解速率达3.24 mg·L-1·d-1.SDM处理初期以吸附为主, 24 h后以降解为主.本研究利用转录组技术分析得到了黄孢原毛平革菌应对SDM刺激和降解SDM的功能基因.在降解SDM后的菌株与不添加SDM培养的菌株的转录组结果中, 共获得了2511个差异表达基因, 说明黄孢原毛平革菌可以通过基因的上下调来应对SDM的刺激, 维持细胞生长的正常进行.在差异表达基因的GO富集分类和KEGG富集代谢通路中, 富集到参与SDM降解和对环境应激的路径, 如“氧化还原酶活性”和“ABC转运体”.高表达高差异基因的筛选结果表明, 黄孢原毛平革菌对环境的耐受依赖于调控SDM跨膜运输相关的基因和解毒相关的基因, 主要是水通道蛋白、ABC转运蛋白和甲基转运酶基因等.黄孢原毛平革菌对SDM依赖于调控菌株的一些氧化还原酶和水解酶基因, 尤其是乙醇氧化酶、细胞色素P450和糖苷水解酶.本研究为黄孢原毛平革菌降解磺胺的功能基因和降解机理提供了丰富的基因数据, 同时也为磺胺类抗生素污染的微生物修复技术提供了理论参考.
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