2021, Vol. 41
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2. 内蒙古大学生态与环境学院, 呼和浩特 010021
2. School of Ecology and Environment, Inner Mongolia University, Hohhot 010021
随着养殖业发展, 畜禽粪便大量产生, 其含有大量有机物及丰富的氮、磷和钾等营养物质, 是可开发利用的宝贵资源.然而, 抗生素的广泛使用使粪便中富集了大量抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs), 这些ARGs可能会通过直接或间接接触(如食物链)等途径进入人体, 增加人体的耐药性, 给人类公共健康带来威胁(吴楠等, 2010；赖晓琳等, 2019).此外, 为加快畜禽生长速度、提高饲料利用率和防止畜禽疾病, 重金属类饲料添加剂同抗生素一起被添加到畜禽饲料中, 其和抗生素在畜禽体内的消化吸收利用率均较低而被排出体外, 致使畜禽粪便中抗生素和重金属含量较高(詹杰等, 2015).
厌氧消化作为一种有效的资源化处理技术, 不仅能将粪便中的有机物转化为沼气和沼肥, 还能有效去除粪便中的ARGs, 减少ARGs带来的环境风险(石利军等, 2011；Wang et al., 2017).然而, 粪便中的抗生素和重金属残留对厌氧消化中ARGs的消减行为具有较大影响.Wang等(2017)发现粪便中的金霉素会增加对抗性细菌的直接选择压力, 使厌氧消化过程对tetO、tetW、tetX、tetL和I类整合酶基因(intI1)的去除减少了0.18 log·g-1.Zhang等(2019)发现粪便中的铜可通过共同选择增加厌氧消化中ARGs的丰度, 使厌氧消化对tetM、tetO、tetX、tetL和tetW总拷贝数的去除减少了56.1%.四环素(Tetracycline, TC)和重金属锌(Zn)分别为畜禽粪便中残留量较高的抗生素和重金属, 其中TC在畜禽粪便中的浓度达10.20~41.50 mg·kg-1；Zn在畜禽粪便中的浓度达97.05~1966 mg·kg-1, 平均含量达274.58 mg·kg-1(胡献刚等, 2008；鲍艳宇等, 2010；王飞等, 2013).但学术界关于粪便中残留的TC和Zn对厌氧消化中ARGs消减影响的研究却鲜有报道.因此, 研究添加TC和Zn对厌氧消化后ARG变化的影响尤为重要, 研究共同添加TC和Zn对消化后ARGs丰度变化的影响更具有一定的开创性.
本研究以大规模奶牛养殖场中的奶牛粪便为消化原料, 以接近畜禽粪便中TC和Zn平均含量的30 mg·kg-1和300 mg·kg-1分别为设定条件, 研究分别添加TC、Zn以及共同添加TC和Zn对厌氧消化性能及四环素类ARGs变化情况的影响, 以期为了解养殖业中使用抗生素及重金属类饲料添加剂带来的环境风险提供有效的数据积累.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料奶牛粪便取自内蒙古一规模化奶牛养殖场, 其初始性质如下：固含率为3.30%, pH值为7.76, 氨氮(NH4+-N)浓度为839 mg·L-1, 总有机碳(Total organic carbon, TOC)浓度为2856 mg·L-1, 溶解性化学需氧量(Soluble chemical oxygen demand, SCOD) 浓度为10318 mg·L-1.四环素为盐酸四环素(Tetracycline, TC), 添加量为30 mg·L-1；硫酸锌(ZnSO4)添加量为743 mg·L-1(以Zn计为300 mg·L-1).
2.2 试验设计反应于1 L厌氧培养瓶中进行, 培养瓶内加入1 L新鲜牛粪, 充分搅拌以混合均匀, 通氮气5 min以驱除氧气.消化过程产生气体通过输气管收集于2 L量筒中, 使用注射器采集培养瓶内混合液样品.试验包括对照组、添加TC、添加Zn和添加TC+Zn 4个处理, 每个处理设置3个重复.采用(55 ± 1) ℃高温厌氧消化, 通过水浴加热控制温度.
2.3 样品采集与理化因子测定采用排水法集气, 每隔24 h记录日产气量, 并于量筒中气体> 1800 mL时测定气体组分.以日产气量小于5%反应体积(50 mL·d-1)为消化反应终点, 分别于消化反应开始、日产气量出现峰值、日产气量趋于平缓和反应结束时采集培养瓶内混合液.混合液每次采集3 mL, 于5000 r·min-1条件下离心15 min, 上清液于-20 ℃保存, 沉淀物于-80 ℃保存.待消化反应结束后, 上清液统一用于理化因子(TOC、SCOD、NH4+-N和pH值)测定, 沉淀物统一用于ARGs和intI1定量分析.
气体组分采用手持式沼气检测分析仪(MRU OPTIMA7)测定；SCOD采用重铬酸钾分光光度法测定；NH4+-N采用纳氏试剂光度法测定；TOC通过总有机碳分析仪(Elementar vario TOC/TNB)测定, pH值采用pH计(雷磁PHS-3E)测定.
2.4 ARGs与intI1定量分析 2.4.1 DNA提取DNA采用TIANamp Stool DNA Kit(天根)试剂盒提取, 具体步骤根据试剂盒说明书进行, 用超微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)检测其含量及纯度, 选取A260/280值在1.8~2.0之间的DNA用于后续实验.
2.4.2 实时荧光定量PCR(qPCR)选取9种四环素类ARGs(tetA、tetB/P、tetC、tetE、tetG、tetO、tetT、tetW、tetX)和intI1进行PCR检测.通过普通PCR仪(9902, ABI)确定消化原料中存在的目标基因, 检出基因通过实时荧光定量PCR仪(CFX96, Bio-Rad)进行定量检测分析, 所用扩增引物序列、扩增片段大小和退火温度见表 1.qPCR反应体系(20 μL)：10 μL PCR-Mix、0.5 μL引物(10 μmmol·L-1)、1 μL DNA模板、2 μL DNF Buffer、6 μL无菌无酶水.qPCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s, 退火20 s(40个循环)；72 ℃延伸30 s；溶解曲线程序为65~95 ℃, 每0.5 ℃读数, 期间停留30 s.
| 表 1 PCR和qPCR引物序列 Table 1 PCR and qPCR primer Sequences |
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绝对丰度(copies·mL-1)为每毫升样品中基因的拷贝数.相对丰度(copies/16S rRNA copies)为基因拷贝数与16S rRNA基因拷贝数的比值.基因丰度变化量(log)=log10(消化后基因丰度)-log10(消化前基因丰度).
使用Microsoft Excel 2010对试验数据进行整理；利用SPSS 22.0进行单因素方差分析(ANOVA)及Spearman相关性分析, 设定统计检验显著性水平p = 0.05, 若p < 0.05认为具有显著相关性, p < 0.01认为具有极显著相关性；采用Canoco 5.0进行主成分分析(PCA), 使用Origin 8.5作图.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 添加TC或Zn对厌氧消化产气的影响厌氧消化的产气周期共持续50 d.图 1所示为厌氧消化过程中对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的日产气量, 根据日产气量曲线, 分别于第0、4、9、11、17、22、30、40、50 d取样.
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| 图 1 厌氧消化过程不同处理日产气量随时间的变化 Fig. 1 Daily biogas production of different treatments during anaerobic digestion |
对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn产气趋势相同, 厌氧消化反应器均运行稳定.不同处理日产气量首先在第2 d达到第一个小高峰, 这是由厌氧瓶中氮气的释放引起的；在第5 d达到第二个高峰, 并均取得最大值.添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的最大日产气量同对照组均有显著性差异(p < 0.05).对照组最大日产气量为1336 mL·d-1(文中均指1 L发酵原料产气量), 添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn最大日产气量较其分别降低了21.93%、19.39%和29.19%.随着粪便内有机物逐渐分解完全, 20 d后日产气量趋于平缓并保持在180 mL·d-1左右.至消化反应结束时, 对照组总产气量达15218 mL, 添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的总产气量同对照组均呈现显著差异(p < 0.05), 较对照组分别降低了8.04%、8.24%和10.24%.这是因为TC的降解使乙酸盐积累, 反应体系酸化, 从而抑制了厌氧消化产气；而Zn对消化过程所引起的毒性主要取决于其存在形态, 沉淀态Zn对厌氧消化过程没有影响, 溶解态Zn对厌氧消化过程起抑制作用(张佳奇等, 2016)；TC与Zn共同添加会干扰微生物生理活动与功能, 共同竞争微生物代谢系统的活性部位, 对产气量抑制最大(王瑞等, 2013).
厌氧消化产生的沼气中含CH4、CO2、H2S等成分, 其中CH4为主要成分, 图 2为厌氧消化结束后对照组、添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的各组分产量.添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的CH4产量同对照组均具有显著性差异(p < 0.05), 较对照组分别降低了11.62%、6.39%和8.60%.这是因为TC或Zn均可以抑制厌氧消化产甲烷菌的活性, 且共同添加TC和Zn会对其产生协同抑制(尹福斌等, 2016；陈芬等, 2018).添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的CO2和H2S产量同对照组均具有显著性差异(p < 0.05).对照组H2S产量为1.61 μL, 添加Zn和添加TC+Zn的H2S产量则分别达4.84 μL和4.60 μL.这是因为ZnSO4的加入导致消化体系中SO42-质量浓度升高, 在硫酸盐还原菌的作用下大量SO42-被还原成H2S气体.
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| 图 2 厌氧消化不同处理各组分产量 Fig. 2 The Yields of different components of each treatment during anaerobic digestion |
TOC、SCOD、NH4+-N和pH值是厌氧消化中重要的物理化学因子, 消化过程中其变化特征可一定程度上反映厌氧消化性能.对照组、添加TC、添加Zn和添加TC+Zn消化性能均稳定, 理化因子变化趋势相似.图 3a~3d分别为不同处理TOC、SCOD、NH4+-N和pH值随时间的变化曲线.
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| 图 3 厌氧消化过程中不同处理理化因子随时间的变化 Fig. 3 Physicochemical factors of different treatments during anaerobic digestion |
厌氧消化过程中对照组、添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的TOC和SCOD整体均呈下降趋势, 3个实验组的TOC和SCOD同对照组均未呈现显著差异, 消化后不同处理的SCOD降解率均达60%以上.消化结束后对照组TOC和SCOD分别为1250和4887 mg·L-1, 添加TC或Zn使TOC和SCOD略降低, 其中添加Zn的TOC和SCOD分别降至1059和3831 mg·L-1, 这是因为Zn离子是细菌生长必需的微量元素, 其适量添加可维持细菌体内基础代谢的动态平衡, 促进其对小分子有机物的利用(张佳奇等, 2016).
NH4+-N既是微生物重要的氮源, 也是影响厌氧消化稳定性的重要因素(王乐乐等, 2019).厌氧消化过程中NH4+-N呈逐步上升趋势, 添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的NH4+-N同对照组未呈现显著差异.消化第4~11 d时NH4+-N差别较大, 对照组NH4+-N最高, 这与添加TC或Zn促进了厌氧微生物利用小分子含氮有机物有关(陈芬等, 2018).消化结束后3个实验组的NH4+-N浓度与对照组NH4+-N浓度相近, 均达1424 mg·L-1左右, 较消化前增加69.73%.一般认为, 当NH4+-N浓度高于1500 mg·L-1时, 产甲烷菌的活动就会被抑制(李政伟等, 2016).消化中3个实验组的NH4+-N浓度均低于1500 mg·L-1, 未对反应器稳定性产生不良影响.
厌氧消化是消耗H+产生碱的过程(张华生等, 2019), 消化开始后pH值由7.2稳定上升.厌氧消化过程中添加TC、添加Zn和添加TC+Zn的pH同对照组未呈现显著差异, 至消化结束时, 不同处理pH值均达8.1左右.在整个消化过程内, 反应器pH值均利于产甲烷菌活性.
3.3 添加TC和Zn对厌氧消化四环素类ARGs及intI1丰度变化的影响 3.3.1 绝对丰度变化试验选取9种四环素类ARGs(tetA、tetB/P、tetC、tetE、tetG、tetO、tetT、tetW、tetX)进行检测, 共检测到6种四环素类ARGs(核糖体保护蛋白基因tetW、tetO、tetT, 外排泵基因tetC、tetG, 酶修饰基因tetX).图 4a为厌氧消化前后对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的ARGs绝对丰度变化量.
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| 图 4 厌氧消化后不同处理四环素类ARGs绝对丰度变化(a)、相对丰度变化(b) 及intI1相对丰度变化(c) (*代表实验组与对照组具有显著性差异(*表示0.05水平显著差异, **表示0.01水平显著差异) Fig. 4 Variations in absolute abundances(a) and in relative abundances(b) of tetracycline resistance genes and variations in relative abundances of intI1(c) of different treatments after anaerobic digestion |
厌氧消化后对照组粪便中的ARGs总量下降了0.45 log, 这是因为携带有ARGs的微生物在厌氧消化下进行新陈代谢逐渐消亡, 且伴随着质粒消除和转座过程的发生, 导致ARGs丰度降低(杨帆等, 2018).消化后添加TC、添加Zn以及添加Zn的ARGs总量同对照组均具有极显著差异(p < 0.01).添加Zn的ARGs总量降低了0.60 log, 添加TC的ARGs丰度仅降低了0.02 log, 添加TC更不利于ARGs总拷贝数的消减, 这是因为抗生素可对抗性菌进行直接选择(Wang et al., 2017).共同添加TC和Zn大大增强了对抗性细菌的选择性压力, ARGs总量增加达0.40 log.
添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn对核糖体保护蛋白基因tetW、tetO和tetT的去除与对照组均有极显著差异(p < 0.01).添加TC增加了核糖体保护蛋白基因的直接选择压力, 抑制了厌氧消化对tetW、tetO和tetT的去除；共同添加TC+Zn对tetW和tetO抑制作用更加明显.TetW是所测基因中的主导基因, 对照组tetW丰度降低了0.75 log, 添加TC和添加TC+Zn则使其分别升高了0.04和0.55 log, 这直接导致了添加TC和添加TC+Zn的ARGs总拷贝数的增加.添加Zn促进了tetO的去除, 这可能是因为Zn破坏了其宿主菌的调控机制(张佳奇等, 2016).
TetC和tetG均为外排泵基因, 存在于细菌细胞膜上, 可外排抗生素等毒性物质.添加TC和添加TC+Zn对tetC和tetG的去除与对照组均具有极显著差异(p < 0.01), 但添加Zn对tetC的去除与对照组未呈现显著性差异.TetG丰度在对照组未降低, 因为其主要存在于革兰氏阴性菌中(Song et al., 2017), 较难去除, 但由于Zn对革兰氏阴性菌的生存有抑制作用(Chopra et al., 2001；Peng et al., 2018), 因此tetG丰度在添加Zn和添加TC+Zn中的增长得到有效控制.
酶修饰基因tetX可编码合成氧化还原酶, 降解环境中的四环素类药物(田哲等, 2014).添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn对tetX的去除与对照组均具有极显著差异(p < 0.01).对照组的酶修饰基因tetX丰度降低了1.64 logs, 去除率高达97.70%, 是因为tetX宿主菌较为单一, 且垂直转移是其丰度变化的主要原因, 因此厌氧消化对其去除效果较好(Ma et al., 2011).添加TC或Zn抑制了tetX的去除, 且共同添加TC和Zn使抑制作用大为增加, 添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn使tetX丰度仅分别降低1.06、1.37和0.33 logs.TetX可合成破坏四环素结构的酶, 故TC一旦施加就会促进tetX的富集.
3.3.2 相对丰度变化ARGs相对丰度能反映含该种基因的细菌在细菌总量中所占的比例, 这与细菌群落结构相关, 也可能与基因水平转移相关(Mazel, 2006).图 4b为厌氧消化前后对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的ARGs相对丰度变化量.
厌氧消化后添加TC、添加Zn以及添加Zn的ARGs总量同对照组均具有极显著差异(p < 0.01).添加TC或Zn抑制了厌氧消化对ARGs总量的去除, 对照组粪便中ARGs相对丰度总量降低了0.58 log, 添加Zn仅降低了0.39 log, 且添加TC和添加TC+Zn分别上升了0.18和0.86 log.重金属抗药性和抗微生物药性经常连接在同一质粒中, 因此Zn选择压力的施加会促进ARGs在环境细菌种群中的传播, 从而不利于ARGs消减(Ji et al., 2012).同时添加TC和Zn最大程度抑制了厌氧消化对ARGs的去除, 这是因为重金属和抗生素对细菌产生抗生素和重金属抗性的协同、交叉等机制, 加剧了抗生素抗性基因的污染(张俊亚等, 2015).
添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn对核糖体保护蛋白基因tetW、tetO和tetT的去除与对照组均具有显著(p < 0.05)或极显著差异(p < 0.01).添加TC或Zn均抑制了tetW的去除, 共同添加TC和Zn对tetW抑制作用更加明显, 使其丰度较消化前升高0.86 log.TC一旦添加(添加TC和添加TC+Zn)就会使tetW和tetO丰度升高, 这与TC抑制其消散有关(Xiong et al., 2018).
添加Zn和添加TC+Zn后外排泵基因tetC和tetG的丰度与对照组均有极显著差异(p < 0.01), 这是因为细菌暴露于Zn存在的环境中时, 生物膜将会被诱导生长, 同时导致存在于细菌细胞膜上的外排泵基因增多(张佳奇等, 2016).但添加TC对tetC的去除与对照组未呈现显著性差异, 这与图 4a中绝对丰度的显著性差异有所不同, 可能是因为tetC宿主菌的OTU数较高.
添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn对酶修饰基因tetX的去除与对照组均具有极显著差异(p < 0.01).添加TC或Zn抑制了tetX丰度的降低, 且共同添加TC和Zn使抑制作用大为增加, tetX丰度仅降低0.03 log, 与对照组相比去除效果降低了1.41 logs.
3.3.3 IntI1变化及其与ARGs的相关性分析整合酶基因能够捕获外源性基因, 通过转座子或接合性质粒进行ARGs水平转移和传播以表达出多重抗药性特征(Mazel, 2006).IntI1是分布最广泛的整合酶基因, 其对抗生素和重金属及其复合污染环境下细菌抗性的产生起到重要作用(Stalder et al., 2012；张佳奇等, 2016).图 4c为厌氧消化前后对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的intI1相对丰度变化量.
厌氧消化后添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的intI1相对丰度总量同对照组均具有极显著差异(p < 0.01).对照组粪便中intI1相对丰度升高了0.30 log, 添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn均促进了intI1丰度的升高, 其中添加TC升高达1.53 log.与对照组相比, 添加TC或Zn使ARGs间水平转移大大增强, 这可能是导致tetC、tetT、tetW和tetX去除率降低的原因之一.Zhang等(2020)通过向猪粪厌氧消化中分别添加金霉素和铜, 发现添加铜和共同添加金霉素和铜均促进了消化后intI1丰度的升高, 而仅添加金霉素使消化后intI1丰度降低.这可能是由金霉素与四环素结构的不同引起的, 金霉素中含氯离子, 对intI1的潜在宿主菌革兰氏阳性球菌的灭活效果远高于四环素(Sun et al., 2018).ARGs的去除与intI1的变化之间具有一定联系, 表 2为各ARGs与intI1丰度间Spearman相关性分析结果.
| 表 2 ARGs和intI1间Spearman相关性分析 Table 2 Spearman′s correlation analysis between ARGs and intI1 |
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TetW和tetO的基因编码机理相同, 均为核糖体保护蛋白基因, 其去除也呈显著正相关(p < 0.05).TetT和tetX呈显著正相关(p < 0.05), 这可能与tetT和tetX含有大量相同的宿主菌有关(Sun et al., 2016；Song et al., 2017).IntI1与tetG呈显著正相关(p < 0.05), 与tetT呈显著负相关(p < 0.05), 与tetX呈显著负相关(p < 0.01), 这可能是因为intI1的去除减少了tetG宿主菌的水平转移, 而intI1宿主菌与tetT和tetX的宿主菌具有竞争关系(Sun et al., 2018).Sun等(2018)对奶牛厂废水进行厌氧消化, 也发现intI1与tetG呈正相关性, 这与intI1丰度的降低减少了其潜在宿主菌Hydrogenispora和Advenella的水平转移有关.
3.4 不同处理样点的主成分分析(PCA)根据厌氧消化12个反应器所取样品, 对消化后对照组、添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn的样点进行主成分分析(Principal component analysis, PCA).PCA1和PCA2的贡献率分别为80.92%和13.57%, 总贡献率达94.49%(图 5).不同处理样点分布差异较大, 对照组样点分布在第三象限, 而添加TC、添加Zn以及添加TC+Zn样点分别分布在第一、二和四象限, 说明添加TC或Zn对厌氧消化后单一基因丰度削减的抑制或丰度增加的促进作用大为不同.根据样点分布可看出, 添加TC更易对tetT和intI1产生影响, 添加TC+Zn更易对tetG、tetO、tetW和tetX产生影响, 而添加Zn对厌氧消化中单一基因的影响不突出.
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| 图 5 不同处理间样点的主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of the samples of different treatments |
由图 5可知, 添加TC或Zn不利于NH4+-N累积, 有利于SCOD和TOC降解.TetT和tetC与pH成正相关, 与NH4+-N、SCOD和TOC成负相关, 说明pH值增大以及NH4+-N、SCOD或TOC减小均不利于tetT和tetC的去除.IntI1与pH值成正相关, pH值升高, intI1丰度增加.
4 结论(Conclusions)1) 添加四环素(TC)或金属锌(Zn)会抑制厌氧消化产气, 共同添加抑制作用更显著；添加TC或Zn对厌氧消化理化因子(TOC、SCOD、NH4+-N和pH值)无显著影响.
2) 添加TC或Zn对厌氧消化后四环素类ARGs的去除有显著影响, 添加TC比添加Zn更易抑制厌氧消化对ARGs丰度总量的消减.当TC和Zn加入, 尤其是两者共同加入时会明显抑制消化对核糖体保护蛋白基因tetT和tetW、外排泵基因tetC和酶修饰基因tetX的去除.
3) 添加TC或Zn会促进厌氧消化后intI1丰度的升高, 添加TC影响尤为显著.
4) 粪便中TC与Zn共同残留对厌氧消化消减ARGs的抑制作用远大于其中任一因子带来的抑制作用, 这是需要关注的一大重要问题.
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