1 引言(Introduction)

土壤重金属污染是城市面临的重要生态问题(王帆宇, 2016；Sarwar et al., 2017).相关研究表明, 北京地区土壤中重金属镉(Cd)含量突出, 需引起重视(韩玉丽等, 2015; 孙春媛等, 2016；杨少斌等, 2018).园林树木是城市生态建设的重要组成部分, 对重金属有吸收作用(崔冠卿, 2012; Pollard, 2016；Alahabadi et al., 2017).其中, 杨、柳(郭艳丽等, 2009)、忍冬(刘周莉等, 2013)、山矾(顾翠花等, 2015)是较理想的Cd富集性树种.重金属被植物吸收后, 会以不用的化学形态贮藏在各组织中, 其在植物体内的移动被限制, 以减轻对植物的毒害作用(Li et al., 2016).重金属的亚细胞定位可以揭示植物对重金属的积累和耐受机制, 植物的细胞壁、液泡等被认为在重金属耐受过程中发挥着重要作用(Gallego et al., 2012；Clemens et al., 2013).目前, 已发现Cd在一些木本植物亚细胞中的分布特点, 如杨柳科植物旱柳(杨卫东等, 2008)、灰杨(代惠萍, 2012；何佳丽, 2014)、秋华柳(李瑞等, 2018), 农林经济植物桉树(廖妤婕, 2014)、苹果砧木(Zhou et al., 2017), 以及园林植物马缨丹(方继宇等, 2014)、栾树(Yang et al., 2018)、三角梅(Wang et al., 2017).总体而言, 所涉及的园林乔木种类仍较少, 且Cd在各乔木树种中的亚细胞分布和化学形态特征具有差异, 但鲜有研究同时以多种木本植物为研究对象, 在同一实验条件下, 探索其积累机制的异同.栾树(Koelreuteria paniculata)、臭椿(Ailanthus altissima)、银杏(Ginkgo biloba)是北京园林中应用非常广泛的乡土树种, 适应性强(张国静等, 2012), 且前期实验研究发现这3种乔木对Cd具有一定的富集能力(唐敏等, 2019).因此, 研究这3种乔木对Cd的富集规律、细胞超微结构变化以及Cd在亚细胞中的分布和化学形态特征, 探索3种乔木对Cd积累特征与解毒机理, 旨在为Cd污染土壤的植物修复方法提供参考和依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 植物培养

臭椿、栾树和银杏实生苗(1年生)购买于北京市顺义区苗木基地.试验基质土配比为草炭土∶珍珠岩=8∶2(体积比), 称取5 kg基质土装于口径24 cm, 高度26.5 cm的3加仑塑料盆中, 盆下垫托盘.试验设置Cd处理梯度5个(0、25、50、100、200 mg·kg^-1), 每个梯度含4盆重复样, 供试Cd离子来源于药品CdCl₂·2.5H₂O(分析纯).4月初, 挑选长势良好和生长一致的植株进行移栽, 每盆栽植1株, 移栽后马上浇一次透水作为定根水, 置于阴凉通风的大棚环境下缓苗1个月.随后将盆栽苗木移到露天自然环境下, 在盆土中均匀插孔.按照设定的处理浓度, 准确称量CdCl₂粉末药品溶解于1.2 L的去离子水中(若超过该水量, 浇灌后溶液会从盆底渗漏), 利用气压喷壶使CdCl₂溶液呈喷雾状均匀地通过孔隙渗透到土壤中, 以保证药品和土壤混合均匀.试验期间雨天用塑料布进行遮雨处理, 盆土保持自然肥力, 不施肥, 每周等量浇入淡水1或2次.9月初, 采用完全收获法进行样品采集.植株用自来水冲洗干净后, 将根部在20 mmol·L^-1 Na₂-EDTA溶液中浸泡20 min, 去除根表吸附的Cd, 再用去离子水冲洗3次并擦干, 分成叶、枝、根3个部分.部分植物样品用于测定亚细胞组分和不同化学形态Cd含量, 保存于-80 ℃冰箱, 剩余样品在105 ℃下杀青30 min, 再用70 ℃烘干至衡重, 最后用粉碎机磨细干燥保存.

2.2 测定指标及测定方法 2.2.1 各器官Cd含量的测定

用万分之一电子天平称取叶、枝、根粉末干样各1 g, 采用HNO₃-H₂O₂微波消解体系消解(黄晓纯等, 2013).消解定容后, 采用ICP-OES(Agilent 5110)测定Cd含量, 试验重复3次.

2.2.2 细胞超微结构的观察

取植物叶片鲜样5~8 mm², 投入4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定液中, 固定液完全浸没样品后放入4 ℃冰箱保存.准备制片时倒掉固定液, 然后用磷酸缓冲液(PH 7.0)将样品漂洗3次, 每次15 min；在样品中加入1%的锇酸溶液浸没1~2 h；倒出锇酸溶液, 然后用磷酸缓冲液(pH 7.0)将样品再次漂洗3次, 每次15 min；后用30%、50%、70%、80%、90%和95% 共6种浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理, 每种浓度处理15 min；再用100%的乙醇处理20 min；最后用纯丙酮处理20 min.将样品用包埋剂与丙酮的混合液(体积比1∶1)浸没1 h；再用包埋剂与丙酮的混合液(体积比3∶1)浸没样品3 h；将样品浸没在纯包埋剂过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来, 70 ℃加热过夜, 完成样品包埋工作.用超薄切片机(LEICA EM UC7型)对包埋好的样品进行切片, 保持切片厚度为70~90 nm, 用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液对切片各染色5~10 min, 最后在透射电镜(HT-7700型)中观察(李叶等, 2016).

2.2.3 亚细胞组分的分离

采用差速离心法分离不同的细胞组分(周芙蓉等, 2012；Yang等, 2018).称取植物冰冻样品1 g, 加入40 mL缓冲液(0.25 mol·L^-1蔗糖+50 mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1 mmol·L^-1二硫苏糖醇(DTT)), 缓冲液少量多次加入, 在4 ℃低温下用研钵将样品研磨成匀浆.然后转移到50 mL离心管中, 使用冷冻离心机(4 ℃)按图 1步骤进行细胞组分逐级离心分离.其中, F₁为细胞壁及未破碎残渣, F₂为细胞核为主的成分, F₃为线粒体和叶绿体成分, F₄为核蛋白成分和可溶性组分(可溶性组分包括细胞质、液泡内大分子及无机盐离子及核糖体).

2.2.4 不同化学形态Cd的提取

采用化学试剂逐步提取法(Lu et al., 2017).称取植物冰冻样品1 g, 加入20 mL提取剂(少量多次加入), 用研钵将样品研磨成匀浆.然后转移至离心管中, 放入25 ℃的恒温培养箱振荡22 h, 然后在离心机4000 r·min^-1转速离心15 min, 将上清液分离, 向离心管的沉淀中再加入10 mL的提取剂, 在25 ℃恒温振荡1 h后, 于4000 r·min^-1转速离心15 min, 将两次离心后的上清液合并.采用5种提取剂依次逐步提取：80%乙醇(F_E)、去离子水(F_W)、1 mol·L^-1 NaCl溶液(F_NaCl)、2% HAc(F_HAc)、0.6 mol·L^-1 HCl(F_HCl), 最后为残留态(F_R).

将上述利用差速离心法和化学试剂逐步提取法分离的上清液和沉淀组分装入三角瓶中, 置于电热板(70 ℃)上蒸发至近干后, 采用HNO₃ -HClO₄法消解.消解定容后, 采用ICP-OES(Agilent 5110)测定Cd含量, 试验重复3次.

2.3 数据处理

本文采用滞留率(程龙玲等, 2012)来反应根系对Cd的滞留作用, 根系对重金属的滞留率(%)=(根系重金属含量-枝叶重金属含量平均值)/ 根系重金属含量×100%.实验数据采用SPSS 23.0统计软件对数据进行处理, 采用最小显著差异法(LSD)进行数据组间的差异分析, 显著性水平设定为α=0.05.采用Person法进行相关性分析.数据为3次重复样品测定结果的平均值.

3 研究结果(Results) 3.1 3种乔木各器官中Cd含量的对比

结果表明, 栾树和臭椿各器官的Cd含量高于银杏, 随着Cd处理浓度的增加, 差异更为显著(表 1).低浓度(25、50 mg·kg^-1)处理时, 3种乔木对Cd的总含量排序为臭椿>栾树>银杏.高浓度(100、200 mg·kg^-1)处理时, 总含量排序为栾树>臭椿>银杏.随着土壤Cd处理浓度的增加, 3种乔木各器官Cd含量均呈上升趋势.栾树和臭椿各器官分布特征通常表现为根>枝>叶, 银杏为根>叶>枝.当处理浓度为200 mg·kg^-1时, 栾树、臭椿、银杏根中的Cd含量分别可达其枝条的5.84、2.19、7.30倍, 叶片的13.57、11.10、5.71倍.可见, 根部是3种乔木积累Cd的主要部位, 对Cd具有较强的滞留作用, 滞留率最高可达88.13%(臭椿在Cd处理浓度为50 mg·kg^-1时).

3.2 3种乔木在Cd胁迫下的细胞结构对比

当植物受到重金属胁迫时, 植物细胞组织的微观结构会发生一定程度的变化.为了探究Cd胁迫对3种乔木叶片结构变化的影响, 通过透射电镜观察了3种乔木在Cd胁迫下叶片组织形态的微观变化.Cd胁迫下, 栾树和臭椿叶片出现大量黑色絮状物, 细胞壁及细胞器的表面被其附着, 叶绿体数量减少且叶绿体类囊体膜溶解, 片层结构模糊不清, 严重时出现解体与溃散特征(图 2c~2f, 2i~2l).高浓度Cd处理时, 栾树叶片细胞的细胞壁发生扭曲变形与破裂现象, 细胞器散乱, 细胞结构被破坏(图 2e~2f).而银杏叶片细胞受Cd胁迫影响较小, 细胞完整, 无显著毒性症状.细胞内没有大量黑色絮状物, 虽叶绿体因淀粉粒变大有肿胀的特征, 观察到有质体小球存在于叶绿体中, 但叶绿体形状仍能保持规则, 叶绿体膜仍基本完整并保持连续, 片层结构基本清晰(图 2o~2r).可见, 栾树和臭椿叶片细胞损伤程度高于银杏.

3.3 3种乔木叶片和根系亚细胞中Cd的分布

栾树叶片各亚细胞组分Cd含量比例表现为各浓度胁迫下细胞壁组分占比显著高于其它组分(65.58%~78.54%).臭椿叶片各亚细胞组分Cd含量比例在低浓度时(25、50 mg·kg^-1)表现为细胞壁组分占比最高(38.92%~39.35%), 高浓度时(100、200 mg·kg^-1)表现为可溶性组分占比最高(41.38%~52.39%).银杏叶片各亚细胞组分Cd含量比例在中低浓度时(≤100 mg·kg^-1)表现为可溶性组分占比最高(50.00%~66.67%), 当Cd处理浓度达到高浓度200 mg·kg^-1时, 细胞壁组分(40.63%)Cd含量占比超过了可溶性组分(32.81%).Cd处理下, 栾树和臭椿根系各亚细胞组分Cd含量比例表现为细胞壁组分占比(栾树：45.75%~57.27%；臭椿：39.39%~56.69%)显著高于其它组分.银杏根系各亚细胞组分Cd含量比例在低浓度时(50 mg·kg^-1)差异不显著, 在高浓度时(100、200 mg·kg^-1)细胞壁组分占比(60.54%~66.57%)显著高于其余组分.可见, 3种乔木叶片中的Cd主要储存在细胞壁和可溶性组分中, 根系中的Cd主要储存在细胞壁组分中, Cd在细胞核、线粒体和叶绿体等细胞器组分中占比很小.

3.4 3种乔木叶片和根系中Cd的形态研究

Cd胁迫下, 3种乔木叶片中均以移动性和毒性相对较低的HAc提取态Cd分配比例最大(栾树：42.86%~66.99%；臭椿: 22.61%~39.20%；银杏：22.86%~34.92%), 且随着Cd处理浓度的升高, HAc提取态Cd分配比例均呈上升趋势.同一Cd处理浓度下, 活性和毒性最强的乙醇提取态和水提取态Cd在3种乔木叶片中的分配比例通常表现为银杏>臭椿>栾树.3种乔木根系中均以移动性和毒性相对低的NaCl提取态Cd分配比例(栾树：66.81%~80.32%；臭椿: 21.68%~43.70%；银杏：34.76%~69.46%)最大.但随着Cd处理浓度的升高, 3种乔木根系中NaCl提取态Cd分配比例变化趋势不同, 栾树根系中呈上升趋势, 臭椿根系中先下降后又上升, 银杏根系中呈下降趋势.低浓度Cd(25、50 mg·kg^-1)处理时, 活性和毒性最强的乙醇提取态和水提取态Cd在3种乔木中的分配比例表现为臭椿>银杏>栾树.高浓度Cd(100、200 mg·kg^-1)处理时, 乙醇提取态和水提取态Cd在3种乔木中的分配比例表现为银杏>臭椿>栾树.

4 讨论(Disscusion) 4.1 3种乔木各器官中Cd含量的对比

本试验发现, 栾树和臭椿体内的Cd含量分布通常为根＞枝＞叶, 银杏为根＞叶＞枝, 各器官Cd含量均随着土壤中Cd浓度的增加而增加, 且差异性显著.Cd在根系中过量积累, 主要原因可能是根系组织的内皮层细胞起到了横向截留作用, 限制了Cd向地上部转运, 从而导致植物地上部与根系中Cd的分布差异(王晓娟等, 2015).大多研究表明不同种类植物以及不同植物器官对Cd的吸收、累积能力有所不同, 但Cd进入植物体内后绝大部分累积在根部.如香樟、天竺桂、君迁子、银杏对Cd的吸收富集均表现为：根＞茎＞叶, 根部积累量占植株吸收总量的39.54%~89.28%(鲁艳, 2017).本研究与前人做的结果相似, 可见木本植物对Cd的运输途径有相似之处.

4.2 3种乔木在Cd胁迫下的细胞结构对比

高浓度的Cd会损害植物根系, 减少养分的吸收, 抑制叶绿素的合成, 影响植物的生长(李秀珍等, 2008；Demim et al., 2013; ).在本实验中观察到, Cd胁迫会导致乔木叶片细胞中叶绿体的不规则排列和类囊体膜溶解.原因可能是Cd的过量积累会结合叶绿体中蛋白质上的巯基, 并取代铁、锌、镁等相关营养元素, 导致叶绿体的结构和功能活性受到破坏(安志装等, 2002).此外, Cd引起的超量活性氧自由基将叶绿素作为靶分子, 也可致使叶绿素结构破坏(何翠屏等, 2003).对比前人研究发现, Cd对植物的毒害作用具有相似性.如Cd处理后, 美洲商陆叶片细胞部分叶绿体挤在一起, 且肿胀变形, 类囊体片层结构减少甚至消失, 淀粉粒增大(Fu et al., 2011).毛竹幼苗使用50 μmol·L^-1的Cd²⁺水培溶液处理后, 叶片细胞中叶绿体轮廓出现不规则的形状, 叶细胞叶绿体类囊体膜溶解, 细胞壁扭曲变形, 细胞结构被破坏(李松, 2015).

4.3 3种乔木叶片和根系亚细胞中Cd的分布

3种乔木在Cd胁迫下, 大部分Cd均存在于细胞壁和可溶性组分, 细胞器组分中很少.细胞壁是重金属进入细胞的第一道屏障, 植物的细胞壁可将重金属与果胶和蛋白质结合, 从而减少其跨膜运输, 降低细胞原生质体内重金属的浓度(刘清泉等, 2014).可溶性部分主要由液泡组成, 液泡含有许多蛋白质, 糖和有机酸, 它们可以与重金属结合以降低其有效性, 减少进入细胞器的重金属数量(He et al., 2013；Li et al., 2014).对3种乔木各器官中Cd含量和亚细胞分布比例进行相关性分析, 发现3种乔木叶片中Cd含量与叶片细胞壁组分Cd占比呈正比, 相关性系数为0.627(p < 0.05)；3种乔木叶、枝、根中Cd含量与其叶片中叶绿体和线粒体组分Cd占比呈反比, 相关性系数分别为-0.787(p < 0.01)、-0.691(p < 0.01)、-0.579(p < 0.01), 可见3种植物对Cd的积累能力与其体内Cd的亚细胞分布特征密切相关.Uraguchi et al.(2009)研究了两种不同基因型的黑燕麦, 发现在高积累且耐受品种中细胞壁的Cd含量随着Cd胁迫浓度的增加而增加, 且含量显著高于低积累品种.Xin et al.(2017)对敏感型和耐受型品种萝卜进行研究, 发现Cd敏感型的品种Cd主要分布在叶片的可溶性组分, 根系的细胞壁组分, 而耐受型品种中Cd在叶片和根系中都主要分布在可溶性组分.彭秋等(2019)以高、中、低Cd积累型品种辣椒为研究对象, 发现根、茎、叶、果各亚细胞组分中Cd含量均表现为细胞壁＞细胞器＞可溶性组分, 没有明显差异.总而言之, 受实验植物种类和实验条件的影响, 目前在耐受与敏感型植物或是高积累与低积累型植物的亚细胞中未发现Cd的分布特征有统一差异.

4.4 3种乔木叶片中Cd的形态研究

重金属经过植物吸收、转运后, 会以不同化学形态存在于植物的各器官组织中, Cd在植物体内的迁移能力及毒性与化学形态密切相关(Mukherjee et al., 2018；Yao et al., 2019).所提取的重金属的活性随着提取剂(乙醇、去离子水、氯化钠、醋酸、盐酸)极性的增加其毒性和活性不断下降, 对植物的毒害作用也随之减小, 6种化学形态的Cd毒性排序为F_E > F_W > F_NaCl > F_HAc> F_HCl> F_R(Bais et al., 2006; Wang et al., 2012).本研究中, 随着Cd处理浓度的升高, 3种乔木叶片中HAc提取态Cd分配比例均呈现出上升趋势, 但根系中NaCl提取态Cd分配比例变化趋势不同.对3种乔木器官中Cd含量和各化学形态分配比例进行相关性分析, 发现3种乔木叶、枝、根中的Cd含量与其叶片中HAc提取态Cd分配比例呈正比, 相关性系数分别为0.820(p < 0.01)、0.527(p < 0.05)、0.668(p < 0.01), 说明3种乔木对Cd的积累能力与其体内Cd的存在形态密切相关.总结前人研究发现虽然不同植物中Cd存在形态有一定的差异, 但大多都遵循以下规律：外界Cd胁迫不断增加时, 植物体内迁移能力和毒性较低的Cd形态分配比例保持最大或升高, 从而减轻Cd对植物的毒害作用(陆仲烟等, 2013；白雪等, 2014；Lai, 2015).

5 结论(Conclusions)

1) 3种乔木对Cd的积累含量有较大差异, 栾树和臭椿体内Cd含量远高于银杏.通过叶片细胞超微结构观察, 发现银杏细胞对Cd的耐受能力强于栾树和臭椿.因此, 对Cd积累能力强的植物并不一定对Cd耐受能力强.

2) Cd在3种乔木叶片和根系亚细胞结构上主要分布于细胞壁和可溶性组分中, 叶绿体、线粒体和细胞核等细胞器中Cd含量较少.3种乔木各器官中Cd的积累含量与其叶片中叶绿体与线粒体组分Cd占比呈显著负相关关系, 说明细胞壁固定与液泡区隔化作用可能是3种乔木积累与耐受Cd的重要机制.

3) Cd在3种乔木叶片和根系中分别主要以毒性较低、活性较弱的HAc和NaCl提取态Cd存储.3种乔木各器官对Cd的积累含量与其叶片中HAc提取态Cd分配比例呈显著正相关关系, 说明将体内的Cd向低毒性低移动性的形态转化也可能是3种乔木应对Cd胁迫的重要策略.