1 引言(Introduction)

随着废水生物处理技术的发展, 具有除污效果好、投资低、操作方便等优点的活性污泥法被广泛应用(Yuan et al., 2019; 王健等, 2020; 赵婷婷等, 2020), 但该方法也存在污泥结构松散、沉降速率低、易产生污泥膨胀等问题(高春娣等, 2020), 导致出水TN和TP等不达标.因此, 改进活性污泥法、提高其污水处理效能迫在眉睫.

近年来, 磁性材料逐渐兴起, 越来越多的磁性材料被应用到污水处理中.研究发现, 利用磁化作用和生物的磁效应可提升污泥沉降性能, 增加活性污泥浓度, 加强污水处理能力, 改善絮体结构, 减少污泥膨胀(Rocha et al., 2020; 冯嘉颖等, 2020; 薛晨楠等, 2020).单独的Fe₃O₄纳米颗粒因具有强磁性而易团聚和氧化, 使其在液相中不稳定, 从而影响其与活性污泥的混合及在水处理中的应用(展思辉等, 2016).因此, 对Fe₃O₄表面进行修饰, 以改善其性能成为国内外学者研究的热点.如管蕾等(2020)采用SiO₂修饰Fe₃O₄得到Fe₃O₄@SiO₂, 发现其能改善活性污泥的沉降性能, 提高SBR的脱氮除磷性能.唐玉兰等(2016)采用柠檬酸三钠对Fe₃O₄进行改性, 发现改性后的Fe₃O₄表面增加了许多反应性官能团, 如羧基、氨基等, 从而改变了颗粒的分散性或相容性.由此可见, 改性的磁性材料在水处理中具有更大的优势.如Ji等(2018)采用水热合成法制备Fe₃O₄@C, 发现由于碳对Fe₃O₄进行包裹, 在其表面产生了亲水基团, 使Fe₃O₄表面带负电荷, 从而提高了静电斥力, 并提高了Fe₃O₄的稳定性和亲水性, 增强了其对特殊环境的适应能力；同时, 该研究发现Fe₃O₄@C具有更高的吸附位点暴露效率和更好的吸附性能.陈齐亮等(2018)在常压下制备了Fe₃O₄@C, 并探究了其对水中亚甲基蓝的吸附性能, 发现Fe₃O₄@C表面分布有大量不规则的孔道.Li等(2020)综述了各种碳改性Fe₃O₄在去除水中污染物方面的应用, 发现碳改性Fe₃O₄对水中污染物的吸附机理包括络合吸附、离子交换吸附、静电吸附、还原吸附、化学沉淀吸附和氢键吸附.

然而, 目前有关Fe₃O₄@C对活性污泥法影响的研究鲜有报道.因此, 本文通过研究磁性纳米Fe₃O₄@C对序批式活性污泥反应器(SBR)污水处理系统脱氮除磷性能的影响, 并采用高通量测序和实时定量PCR(qPCR)技术分析微生物种群结构及关键脱氮除磷功能菌群变化规律, 以期为磁性纳米Fe₃O₄@C强化SBR工艺脱氮除磷提供实验依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 Fe₃O₄@C的制备

采用共沉淀法(陈齐亮等, 2018)制备Fe₃O₄, 具体过程如下: 称取1.9 g FeSO₄·7H₂O和3.5 g FeCl₃·6H₂O加入到20 mL 0.5 mol·L^-1的盐酸溶液中, 得到FeCl₃与FeSO₄的混合溶液; 称取10 g NaOH与10 g柠檬酸钠, 加入去离子水溶解后转移至500 mL的四口烧瓶中, 水浴加热到80 ℃, 在搅拌及氮气保护下, 将FeCl₃与FeSO₄的混合溶液缓慢滴加到四口烧瓶中, 冷却至室温, 用去离子水洗至中性, 真空干燥12 h, 得到Fe₃O₄; 称取2.0 g Fe₃O₄与6 g蔗糖在少量聚乙二醇溶液中混合均匀, 之后缓慢滴加8 mL浓硫酸, 待碳化2 h后用去离子水洗涤10~12次, 真空干燥12 h, 即得到Fe₃O₄@C.

2.2 实验装置及接种污泥

本实验设置2个相同的SBR(图 1), 反应器有效容积为2 L, 其中, 0号SBR为未投加任何磁性材料的对照组, 1号SBR投加0.5 g·L^-1的Fe₃O₄@C, 接种污泥来自双流县西航港污水处理厂曝气池, 接种量为反应器有效容积的40%.启动时污泥混合液悬浮固体浓度(MLSS)为4274 mg·L^-1, 污泥体积指数(SVI)为202.11 mL·g^-1.反应器每天运行2个周期, 每个周期运行12 h, 包括进水0.5 h、曝气10 h、沉淀(根据运行时间逐步缩短)、排水0.5 h、静置(剩余时间).反应器均置于(32±1) ℃恒温水浴锅中, 曝气量为300 mL·min^-1(溶解氧DO约为4.0 mg·L^-1), 污泥龄SRT约为15 d.

2.3 实验用水

实验进水为模拟生活污水, 葡萄糖、柠檬酸三钠为碳源, 硫酸铵为氮源, KH₂PO₄为磷源, NaHCO₃提供碱度, FeCl₃、CuCl₂等提供微量元素.实验进水指标如下: 化学需氧量(COD)为483.73~510.23 mg·L^-1, 氨氮(NH₄⁺-N)浓度为37.57~46.70 mg·L^-1, 总氮(TN)浓度为43.39~50.28 mg·L^-1, 总磷(TP)浓度为3.42~3.91 mg·L^-1, pH保持在6.9~7.2.

2.4 分析方法 2.4.1 材料表征及水质测试方法

采用X-射线粉末衍射仪(XRD, D8 Advance, 德国布鲁克公司)验证磁性材料的元素和晶体结构, 通过场发射电镜(SEM, Sigma300, 德国Zeiss)和透射电镜(TEM, JEM-2100, 日本)表征Fe₃O₄@C的表面形态和结构.

反应器进、出水TN、COD、TP、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N等均采用国家标准方法测定(国家环境保护总局, 2002).

2.4.2 微生物种群组成分析

分别取运行50 d的污泥样品, 采用Illumina MiSeq系统(上海美吉生物医药科技有限公司)测序平台对污泥进行生物信息学分析, 实验流程包括DNA提取、PCR扩增和Illumina测序(Lim et al., 2020).数据分析参照Liu等所用方法进行, 分别统计样本中Phylum(门)、Class(纲)和Genus(属)的物种丰度(Liu et al., 2017).

2.4.3 实时荧光定量PCR分析

以细菌(16S(338~518))、反硝化菌(nirS)、硝化细菌NSR(Nitrospira、Nitrobacter)、聚磷菌PAO、氨氧化菌AOB的目的基因为引物进行PCR扩增(Maza-Márquez et al., 2020).表 1和表 2分别为各功能菌引物序列和扩增程序(Gabriela et al., 2020).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 Fe₃O₄@C的SEM、TEM和XRD表征

Fe₃O₄@C的SEM和TEM图如图 2a和2b所示, 可以看出, Fe₃O₄@C主要呈球形结构, 大小均匀, 粒径约为80 nm.粒径控制在纳米级, 符合实验要求.Fe₃O₄@C的XRD衍射图谱如图 2c所示.由图可知, Fe₃O₄@C在2θ为30.5°、35.5°、43.1°、53.4°、56.8°、62.7°处可以找到Fe₃O₄在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)晶面的衍射峰, 与标准JCPDS卡片(卡号19-0629)的衍射峰数据基本相同(李晓杰等, 2018), 而且两者的特征衍射峰几乎一致, 表明碳化过程不会改变Fe₃O₄的晶型, 且在2θ小于30°的区域还可发现非晶衍射峰, 表明碳是以无定形的形式负载于Fe₃O₄表面(陈齐亮等, 2018).

3.2 Fe₃O₄@C对活性污泥系统除污性能的影响 3.2.1 COD的去除情况

运行期间, 各反应器COD去除情况如图 3a所示.由图可知, 0号和1号反应器COD平均去除率分别为89.3%和90.14%, 1号反应器COD的去除性能略有增强, 24 d后去除率稳定在90%左右.两个反应器COD去除率均经历了一个先下降再上升再趋于稳定的过程.运行初期(20 d前), 可能由于进水COD负荷太高, 反应器处于适应阶段, 因此去除率下降; 17 d后, 反应器运行稳定, 两个反应器COD去除率上升, 其中, 1号反应器的上升速率高于0号反应器.这是因为首先Fe₃O₄@C具有吸附性能, 可将废水中的COD吸附在材料表面; 其次Fe₃O₄@C具有一定的孔隙, 能够富集更多的微生物, 为微生物生长提供良好的环境, 微生物生长代谢的同时消耗COD, 故1号反应器的COD去除率增强.并且, Fe₃O₄@C能使污泥絮体形成颗粒均匀的磁粉团粒结构, 从而减少生物量的流失, 增强有机物与微生物间的扩散传质, 进而促进对有机物的降解, 提高系统对COD的去除率(王玥婷等, 2018).

3.2.2 TP的去除情况

运行期间, 各反应器内TP变化情况如图 3b所示.由图可知, 两个反应器进水TP浓度在5~10 mg·L^-1之间, 40 d前, 各反应器对TP的去除性能差异较小; 40~70 d, 0号和1号反应器TP平均去除率分别为38.91%和58.76%, 1号反应器除磷性能明显高于0号反应器, 表明Fe₃O₄@C的添加有利于TP的去除.这一方面是因为Fe₃O₄@C的颗粒粒径小、孔隙率丰富、比表面积大、吸附反应活性高, 能有效吸附水中的磷酸盐; 另一方面, Fe₃O₄@C表面的羟基与磷发生络合, 通过配位体交换反应相结合, 带电的Fe₃O₄@C与磷之间的静电吸引作用增强了系统对磷的去除(胡小莲, 2018).同时, Fe₃O₄@C表面的醛基能利用共价键与废水中的胶体、悬浮物、蛋白质、磷酸盐等结合在一起, 进而达到去除污染物的目的(Ling et al., 2019).

3.2.3 氮素变化情况

运行期间, 各反应器内氮素变化情况如图 4所示.由图 4a可知, 前40 d, 0号、1号反应器TN平均去除率分别为32.60%、41.22%;40 d后, TN平均去除率分别为39.64%、65.14%, 1号反应器TN去除率明显高于0号反应器, 表明Fe₃O₄@C的添加对TN去除率贡献较大.各反应器对NH₄⁺-N去除情况如图 4b所示, 两反应器NH₄⁺-N去除率最终均可达到99%以上.NH₄⁺-N和TN去除的同时, 也伴随着NO₃^--N和NO₂^--N的积累, 从图 4c可以看出, 两个反应器内NO₂^--N的积累量保持在1 mg·L^-1以下; 1号反应器内NO₃^--N积累量总体上低于0号反应器, 40 d后这种差距更加明显.这是由于在NH₄⁺-N去除过程中起主要作用的硝化类细菌生长较缓慢, 而Fe₃O₄@C表面有大量孔道, 且由于其良好的亲水性能从而可以截留系统内的反硝化细菌使其不断富集, 进而提高系统内硝化细菌含量, 并有效地将硝酸盐和亚硝酸盐转化为氮气, 即Fe₃O₄@C可增强系统的反硝化作用, 从而强化系统对氮素的去除.

3.3 微生物种群结构分析 3.3.1 各反应器内细菌丰度及多样性分析

Chao、ACE、Shannon、Simpson指数常用于表征系统中细菌群落、物种的丰富度和多样性, 其中, 丰富度指数Chao和ACE用于生态学中物种总数估计, 数值越大代表物种总数越多; Shannon指数则反映了群落物种的多样性, 其数值大小与群落的复杂程度呈正相关; Simpson指数用于估算样本中微生物的多样性, Simpson值越大, 说明优势微生物占总生物量的比例越大; 同时, 物种覆盖度大于99%, 则表明高通量测序的结果可以代表样本中微生物的真实情况(蒋志云, 2019).本研究两反应器内污泥微生物多样性指数如表 3所示.由表可知, 投加Fe₃O₄@C后, 微生物Shannon指数由4.305增长至4.407, Simpson指数从0.055下降至0.045, ACE和Chao指数分别从667、726下降至650、663.表明1号反应器内微生物种群多样性略有增加, 而丰度略有下降, 这与张王超等(2020)的研究结果基本一致.

3.3.2 反应器内污泥种群组成分析Fe₃O₄

@C对SBR内微生物种群组成的影响如图 5所示.门水平上(图 5a), 反应器内的优势菌门分别为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)等.添加Fe₃O₄@C后, 反应器内变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度从23.91%增加至32.14%, 浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度从2.66%增加至5.16%, 硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度从0.46%增加至2.23%;其他门类出现不同程度的下降, 放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度分别下降了0.93%、5.05%、0.2%、2.52%、3.69%.Proteobacteria是常见的聚磷菌(假单胞菌、红环菌、不动杆菌、气单胞菌)所在的门类, 包含多种代谢种类, 在降解有机物的同时完成脱氮除磷的功能(章豪等, 2019).Fe₃O₄@C的添加使反应器内聚磷菌含量增加, 除磷性能提高.有研究表明, 执行厌氧氨氧化过程的细菌均属于Planctomycetes, 该类细菌能够在缺氧条件下以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体, 将氨直接转化成氮气(孙丽, 2019); Nitrospirae和Planctomycetes是脱氮菌所在的门类, Fe₃O₄@C的添加使反应器内脱氮菌含量增加, 脱氮性能随之提高.

纲水平上(图 5b), 两个反应器内优势菌纲分别为放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、norank_p__Saccharibacteria、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)等.添加Fe₃O₄@C后, 反应器内Acidobacteria和norank_p__Saccharibacteria相对丰度大幅下降, 分别下降了4.47%、5.33%, 变形菌纲类相对丰度明显增加, 占细菌总量的比例约为32.49%, 相对丰度提升10.45%.Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria为变形菌门中占比较大的菌纲, 包含许多具备反硝化能力及脱氮除磷能力的菌属, 如红环菌目(Rhodocyclales)、肠杆菌科细菌属(Enterobacteriaceae)及Denitratisoma等菌属(章豪等, 2019).另有研究表明, 进行亚硝化反应的AOB多属于β-变形菌纲(Lim et al., 2020), 有利于系统氨氮的转化和亚硝态氮的积累, 并且β-变形菌纲和γ-变形菌纲中均存在部分反硝化除磷菌, 有利于去除废水中的磷和其他污染物, 在生物脱氮除磷方面起到重要的作用(Thomsen et al., 2007).

属水平上(图 5c), 添加Fe₃O₄@C后, 反应器内主要菌属为Mycobacterium(16.98%)、norank_p__Saccharibacteria(9.68%)、Micropruina(8.37%)、Terrimonas(5.16%)、norank_f__Cytophagaceae(4.87%)、norank_f__Xanthomonadaceae(4.22%)、norank_f__Anaerolineaceae(4.04%)、Lautropia(3.58%)、Woodsholea(2.34%)、norank_f__Blastocatellaceae__Subgroup_4(2.01%)、Nitrospira(1.19%)、Amaricoccus(1.88%)等.两个反应器内的优势菌属为Mycobacterium, 研究发现, Mycobacterium是典型的异养硝化菌, 属于放线菌门, 可将NH₄⁺-N作为硝化底物, 对脱氮起重要作用(侯鸾凤, 2018).但在添加Fe₃O₄@C后, Mycobacterium的相对丰度下降了3.77%, 这是由于反应器内AOB菌的富集, 基质消耗量大, 使NH₄⁺-N浓度降低, 从而使Mycobacterium相对丰度略微下降.但属于放线菌门(Actinobacteria)的微白霜菌属(Micropruina)的相对丰度从4.71%增加到8.37%, 有研究表明, Micropruina是一种脱氮除磷菌, 能够积累细胞聚磷酸盐, 并且在好氧和厌氧条件下均可以利用和贮存各种糖类物质, 对活性污泥去除磷和COD有很大贡献(唐聪聪, 2018), 其丰度的增加促进了SBR系统内COD、氮素和磷的去除.硝化螺旋菌属(Nitrospira)是一种硝化细菌, 属于硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、硝化螺菌纲(Nitrospira), 其相对丰度从0.29%增加到1.19%, 强化了反应器硝化过程.添加Fe₃O₄@C后, 反应器内脱氮除磷功能菌属相对丰度的提升, 使系统呈现出更好的脱氮除磷性能.

3.4 qPCR结果分析及脱氮除磷机理讨论 3.4.1 qPCR结果分析

由图 6可知, 添加Fe₃O₄@C后, 1号反应器内细菌总数明显增长, 16S基因拷贝数从1.77×10⁷ copies·g^-1增长到4.21×10⁷ copies·g^-1, 添加Fe₃O₄@C使反应器内微生物丰度总体得到提升.同时, 反应器内各功能细菌数量均有不同幅度的增长: 1号反应器内PAO数量为8.17×10⁷ copies·g^-1, 是0号反应器的3倍多, 聚磷菌的增加提升了系统除磷性能, 这与3.2.3节的结果一致；nirS基因拷贝数从7.12×10⁶ copies·g^-1增加到1.67×10⁷ copies·g^-1, 对比3.2.1节发现COD的平均去除率从89.3%提高到90.14%, nirS拷贝数的增加间接反映了系统内反硝化潜力的提高, 对系统内COD的去除做出了巨大贡献, 实现了反应器同步脱氮除碳的功能; 与此同时, 添加Fe₃O₄@C前后, Nitrospira、Nitrobacter、AOB菌的拷贝数分别为1.77×10⁷、1.37×10⁷、2.50×10⁴ copies·g^-1和4.20×10⁷、6.46×10⁷、1.43×10⁷ copies·g^-1.3种菌都有不同幅度的增加, 尤其AOB菌增加了3个数量级.AOB菌作为硝化反应的主要菌属, 其数量的增加能显著提高系统的硝化能力, 提高系统的脱氮性能, 这与3.2.2节的结果一致.这些现象揭示了Fe₃O₄@C有助于功能微生物的生长, 从而进一步提高系统脱氮除磷性能.

3.4.2 Fe₃O₄@C强化SBR脱氮除磷机理讨论

投加Fe₃O₄@C后, 由于碳以无定形形式负载在Fe₃O₄表面, 并且对Fe₃O₄起到表面改性的作用, 有效避免了颗粒的团聚, 保证了良好的分散性(朱琳等, 2020), 使Fe₃O₄@C产生亲水基团, 与活性污泥充分混合, 带电荷的材料与活性污泥中带负电荷的基团和废水中的磷酸根离子反应, 起到了除磷的作用, 提升了反应器除磷性能, TP平均去除率可达60%.并且Fe₃O₄@C具有比表面积大、表面活性高、吸附能力强等特点(刘国杰, 2011), 表面的羟基等基团利用共价键与废水中的胶体、蛋白质、悬浮物、磷酸盐等结合, 增加了污泥的密实度, 从而增大污泥粒径, 使较大的污泥形成外部好氧、内部缺氧的环境, 为硝化菌(AOB)、反硝化菌(nirS)及除磷菌(PAO)提供了有利的生活环境, 16S基因拷贝数从1.77 × 10⁷ copies·g^-1增长到4.21 × 10⁷ copies·g^-1, 各功能菌的数量均有显著增加, 从而促进系统脱氮除磷性能.同时, Fe₃O₄@C具有一定的比表面积和孔隙, 能在其表面及孔隙内富集大量微生物, 有利于生长较慢的脱氮功能菌的生长, 从而提高系统脱氮性能, TN平均去除率可达65%, 且由qPCR讨论结果可以看出, 添加Fe₃O₄@C后SBR内主要功能菌为PAO、Nitrospira、Nitrobacter、AOB, 尤其AOB、Nitrospira上升为系统内优势功能菌.综上, Fe₃O₄@C影响SBR脱氮除磷性能机理主要有以下几个方面: ①Fe₃O₄@C产生的亲水基团能使材料与污泥更充分的混合, 本身的磁性及带电性能够与废水中的磷酸根反应, 从而促进磷的去除; ②Fe₃O₄@C本身具有一定的比表面积和孔隙, 能够富集大量微生物, 促进脱氮功能菌的生长, 从而提高系统脱氮性能; ③Fe₃O₄@C能使污泥絮体形成外部好氧、内部缺氧的环境, 为脱氮除磷功能菌提供良好的生存环境, 促进系统脱氮除磷性能.

4 结论(Conclusions)

1) Fe₃O₄@C对SBR脱氮除磷性能有显著影响, 1号反应器TN、TP平均去除率分别为52.18%、56.33%;从第43 d起, 1号反应器脱氮除磷性能明显高于0号反应器, TN去除率增加26.64%, TP去除率增加21.96%.

2) Fe₃O₄@C促进了SBR内微生物增长, 反应器内优势变形菌门Proteobacteria相对丰度从23.91%增加至32.14%;优势脱氮菌门Planctomycetes、Nitrospirae相对丰度分别从2.66%、0.46%增加至5.16%、2.23%;变形菌纲类丰度明显增加, 占细菌总量的比例约为32.49%.与脱氮除磷有关的优势菌属Micropruina、Nitrospira相对丰度分别提高了3.66%、0.90%, 微生物的增长促进了生物间的协同作用, 保证了1号反应器高效脱氮除磷的实现.

3) qPCR结果表明, 添加Fe₃O₄@C后, 1号反应器内各功能基因数量均有大幅增长, 16S基因从1.77×10⁷增长到4.21×10⁷ copies·g^-1.从脱氮除磷功能基因来看, 除磷功能基因PAO增加了3.4倍, 脱氮功能基因nirS、Nitrospira、Nitrobacter、AOB分别增长了2.3、2.4、4.7和572倍.